豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達及單克隆抗體的研制及其初步應用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的成員，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。基因型包括PCV1(Porcine circovirustype1，PCV1)和PCV2(Porcine circovirus type2，PCV2)。PCV1是PK15細胞系的一種污染物，對豬沒有致病性;而PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(Postweaningm

2、ultisystemic wasting syndrome，PMWS)等的主要病原。自1996年以來，PCV2感染引起的疾病在世界各地蔓延，對全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。因此，對于PCV2相關疾病的控制是人們關注的重要問題。
　　PCV1與PCV2的基因組是相似的，都包含兩個主要的開放閱讀框，ORF1和ORF2，ORF1主要編碼與病毒復制相關的蛋白，ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白，PCV1與PCV2的ORF1同源性約為85％，而O

3、RF2的同源性約66％，在PCV1與PCV2之間不產生交叉反應，且ORF2編碼的蛋白是病毒的主要結構蛋白，大小約28 kD，可以刺激機體產生保護性的抗體，因此ORF2基因是PCV2診斷及疫苗研究的熱點。桿狀病毒表達系統(tǒng)已成為基因工程四大表達系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)具有不感染脊椎動物、外源基因克隆量大、重組病毒篩選率高以及表達蛋白活性好的優(yōu)點而被廣泛應用于微生物學、醫(yī)學等領域。本研究利用重組桿狀病毒表達系統(tǒng)使PCV2-ORF2基因在昆蟲細胞中得到

4、表達，并以構建的重組桿狀病毒為免疫原，利用雜交瘤技術，研制針對PCV2的單克隆抗體，為建立準確快速的PCV2診斷方法奠定基礎。
　　首先將PCV2-ORF2基因克隆到桿狀病毒的轉移載體pFastBacTM1中，然后將其轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10Bac中，與DH10Bac中的穿梭載體Bacmid發(fā)生轉座，通過抗性和藍白斑篩選，得到重組桿狀病毒質粒reBacmid-ORF2，通過脂質體介導reBacmid-ORF2轉染Sf9細胞

5、，72小時后Sf9細胞出現(xiàn)明顯病變，提取轉染后細胞的DNA，進行PCR鑒定，成功獲得了表達PCV2-ORF2基因的P1代重組桿狀病毒。檢測蛋白的表達及測定重組桿狀病毒的滴度，將所獲得的重組桿狀病毒經Vivaflow200濃縮后，免疫6～8周齡BALB/c小鼠，免疫后的小鼠效價高者取其脾臟與Sp2/0細胞融合，將融合后的細胞用IFA進行檢測篩選，經多次亞克隆后得到3株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞，分別命名為5H6、4E2、5F7。通過IFA