抗豬圓環(huán)病毒Ⅱ型單克隆抗體的制備及應用.pdf

1、本試驗通過在PK15細胞上增殖PCV2。濃縮純化后，在紫外分光光度計上測得在280nm和260nm處的吸光度，根據公式計算得PCV2濃縮純化后抗原的總蛋白濃度為：Pro(PCV2)=25.1970 mg/ml。 在抗原中加入等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原，免疫8周齡Balb/c小鼠。三免過后，腹腔超強免疫一次，取小鼠的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，經自行建立的間接ELISA方法檢測

2、篩選，獲得3株穩(wěn)定分泌抗PCV2單克隆抗體的雜交瘤細胞株，依次命名為2B5、2D4、3C3。 最終確定ELISA的最佳工作條件為：包被抗原量為25μg/ml，包被液為CBS(PH9.6、0.05M)，包被時間為37℃1h再4℃過夜，封閉物為1％的明膠，酶標二抗做1:1000稀釋。 對篩選的陽性克隆進行特異性鑒定，結果表明：PCV2能有效地阻斷雜交瘤細胞上清，競爭抑制率最高可達80％以上；用PRRS、PPV、PRV代替阻斷

3、試驗中的PCV2，阻斷前后的OD值沒有明顯的變化，說明沒有交叉反應;用純化的抗原包被，豬2型圓環(huán)病毒標準陽性血清檢測試驗結果顯陽性;把PK15細胞按照抗原處理的方法做相同處理，然后包被板子或用細胞培養(yǎng)液包被，陽性雜交瘤細胞上清檢測試驗結果均顯陰性。以上試驗結果均說明，篩選的陽性克隆特異性良好。 經檢測，抗PCV2單抗的雜交瘤細胞上清及小鼠腹水單抗的ELISA效價最高可達1:512和1:102400。各株雜交瘤細胞的平均染色體數目

4、在92-108之間，基本符合SP2/0細胞的染色體數目與正常小鼠脾細胞的染色體數目之和。經過連續(xù)傳代25次和三次凍融復蘇，雜交瘤細胞抗體分泌能力有輕微下降，但仍能穩(wěn)定分泌抗體。 利用腹水單抗建立了檢測PCV2的雙夾心間接ELISA方法。經鑒定，豬源抗PCV2高免血清抗體的效價是1:3200，用時做1:3200稀釋；PCV2腹水單抗的效價是1:102400，用時做1:1600稀釋，檢測靈敏度為80.63ng/ml。此外還建立了檢測