抗豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2蛋白單克隆抗體的制備鑒定及Ⅰ型ORF2基因的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒存在PCV1和PCV2兩種基因型，該病毒屬于圓環(huán)病毒科，其病毒粒子是無囊膜的環(huán)狀單鏈DNA。其中PCV2被認(rèn)為是引起仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的主要病原體，該病可導(dǎo)致新生仔豬高熱、生長發(fā)育不良、體表蒼白以及呼吸障礙等臨床癥狀，該病的發(fā)病率和死亡率差異很大，急性暴發(fā)時死亡率可達(dá)15％以上，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。兩種血清型病毒均包含兩個主要的開放閱讀框ORF1和ORF2，其中ORF1編碼與病毒復(fù)制有關(guān)的Rep蛋白，而OR

2、F2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白。兩種病毒的ORF1段較保守，同源性達(dá)85％；而ORF2段存在著較高的變異性。近年來的研究證實ORF2蛋白是一種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，可自我裝配成類病毒粒子，Blanchard等通過建立ELISA方法證實PCV2-ORF2蛋白可在臨床中用于PCV1和PCV2的鑒別診斷。因此分別對兩種PCV病毒的ORF2段的功能和PCV2診斷方法進(jìn)行研究顯得十分必要。 本試驗中，利用本室構(gòu)建的質(zhì)粒PGEX-ORF2轉(zhuǎn)化BL21

3、(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到PCV2-ORF2的重組蛋白，經(jīng)復(fù)性純化后作為免疫原采取常規(guī)免疫與體外脾臟免疫結(jié)合的方式免疫Balb/C小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0的骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選，獲得了2株抗PCV2-ORF2蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3B2F4和9C3D2，其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價分別為1：1024、1：512，小鼠腹水效價分別為1：204800、1：102400。ELISA結(jié)果

4、顯示，3B2F4和9C3D2僅與融合表達(dá)的PCV2-ORF2蛋白反應(yīng)，而與PGEX-KG表達(dá)的蛋白、PPV、PRRSV不反應(yīng)，說明此兩株單抗特異性好。間接免疫熒光結(jié)果顯示3B2F4和9C3D2能與PCV2發(fā)生反應(yīng)而不與PCV1發(fā)生交叉反應(yīng)，表明本研究所獲得的兩株單抗是PCV2型特異性的。這兩株單抗的獲得為進(jìn)一步研究PCV2-ORF2基因的功能，及建立準(zhǔn)確快速的鑒別PCV1和PCV2的診斷方法提供了強(qiáng)有力的手段。 另外，參照Gen

5、bank上公開發(fā)表的PCV1全基因序列設(shè)計引物，以本室構(gòu)建的質(zhì)粒SK-PCV1為模板擴(kuò)增出PCV-ORF2基因，插入PMD18-T載體，對篩選出的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，將測序結(jié)果同同Genbank上發(fā)表的PCV1基因序列相比較，同源性達(dá)97％，再與Genbank上發(fā)表的PCV2的ORF2基因序列相比較發(fā)現(xiàn)PCV1-ORF2和PCV2-ORF2的差異表現(xiàn)在兩者在核苷酸序列的兩個部位互相存在基因缺失現(xiàn)象。將推導(dǎo)出的PCV1-ORF2的氨基酸序列

6、同PCV2-ORF2進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者在幾個功能區(qū)相當(dāng)保守，尤其是N-末端的核定位序列、N-糖基化位點以及酪氨酸磷酸化位點。將PCV1-ORF2N端的氨基酸序列中具有核定位序列特征的區(qū)域刪除，構(gòu)建缺失核定位序列的PCV1-ORF2基因與綠色熒光蛋白的真核融合表達(dá)載體，同時構(gòu)建PCV1-ORF2全基因與綠色熒光蛋白的真核融合表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，可觀察到后者綠色熒光聚集在細(xì)胞核區(qū)域；而前者轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞結(jié)果顯示核定位現(xiàn)象消失，