豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的克隆與序列分析及其真核表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，無囊膜，基因組為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒。分為PCV1和PCV2兩個基因型，PCV1無致病性，是豬源細(xì)胞系PK-15的污染物，在健康豬體內(nèi)可檢測到PCV1的抗體;PCV2有致病性，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porci

2、nedermatitisandnephropathysyndrome，PDNS)及繁殖障礙等的重要病原。PCV2基因組含有兩個主要的開放閱讀框，其中ORF2基因編碼病毒的核衣殼蛋白Cap蛋白，蛋白的分子量大小約為30kD，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是PCV2的主要免疫原。盡管兩個基因型ORF2基因的同源性達(dá)68％左右，但它們刺激機體產(chǎn)生的抗體沒有交叉反應(yīng)，因此ORF2蛋白在診斷及疫苗研究中具有重要意義，是PCV2的研究熱點。
　　

3、 1.依據(jù)從臨床斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)死亡豬病料中分離且已進(jìn)行基因組測序的PCV2（SD-11株）毒株和本實驗室保存的PCV2XSC毒株(GenBank登錄號為DQ104422)的基因序列，分別設(shè)計合成一對引物，用于擴增ORF2全基因，并分別將其克隆到pMD18-Tsimple載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-ORF2，酶切鑒定并測序。將這兩株P(guān)CV2ORF2序列與GenBank中公布的國內(nèi)外10個不同毒株的PCV2OR

4、F2核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行同源性比較并繪制進(jìn)化樹。結(jié)果表明，SD-11毒株的ORF2基因與比較的10個毒株的同源性均較低，其中核苷酸同源性在90.2％～93.2％之間，氨基酸同源性在87.6％～94％之間，與美國毒株（GenBank登錄號為DQ397521.1）的同源性最高，可達(dá)94％，進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該毒株的ORF2基因形成了一個獨立的分支，表明該毒株與所比較的10個毒株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);XSC毒株與中國分離株09GDLB(GenBan

5、k登錄號為HQ395027.1)及韓國分離株C7155（GenBank登錄號為FJ905463.1）ORF2的核苷酸及氨基酸同源性較高，均在98.7％以上，進(jìn)化樹分析表明XSC毒株與韓國C7155分離株形成了一個小分支，以上結(jié)果說明SD-11毒株及XSC毒株在我國的流行或與種豬的引進(jìn)有關(guān)。
　　 將PCV2SD-11毒株及XSC毒株的全基因組、ORF1及ORF2基因分別與不同基因型的PCV參考毒株(PCV1、PCV2a、PCV2

6、b、PCV1/2a、PCV2c)進(jìn)行比較，結(jié)果表明PCV2SD-11毒株與PCV2a（GenBank登錄號AJ223185）的同源性最高，推測SD-11毒株為PCV2a基因型;XSC毒株的全基因組、ORF1及ORF2基因與PCV2b(GenBank登錄號AY909004)毒株的同源性最高，推測XSC毒株為PCV2b基因型。
　　 2.根據(jù)PCV2a分離株及GenBank公布的PCV2bXSC毒株基因序列，分別設(shè)計合成一對引物，對

7、PCV2a和PCV2b毒株的ORF2基因進(jìn)行PCR擴增。將ORF2基因分別克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1中，獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFast-ORF2a及pFast-ORF2b，分別轉(zhuǎn)化含穿梭載體Bacmid的感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac，發(fā)生轉(zhuǎn)座作用，經(jīng)藍(lán)白菌落篩選得到含ORF2基因的重組穿梭載體reBacmid-ORF2a及reBacmid-ORF2b，用脂質(zhì)體法將重組穿梭載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，獲得的重組病毒分別命名為reBa

8、cmid-ORF2a-Cap及reBacmid-ORF2b-Cap。感染重組桿狀病毒的細(xì)胞經(jīng)RT-PCR檢測到了PCV2a和PCV2bORF2基因的mRNA;間接免疫熒光檢測結(jié)果表明，表達(dá)的重組蛋白能夠被豬抗PCV2高免血清識別;SDS-PAGE與Westernblotting分析均可見大小約為30kD的特異性條帶，表明reBacmid-Cap在sf9細(xì)胞中成功表達(dá)了PCV2a和PCV2b的ORF2蛋白;用終點稀釋法、間接免疫熒光法及噬