豬圓環(huán)病毒2型去除NLS ORF2基因的原核表達和瓊脂擴散實驗檢測方法的建立.pdf

1、圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus，PCV)屬圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬成員，為單股、環(huán)狀、負鏈、無囊膜的DNA病毒，是己知的最小動物病毒之一，大小約17～20nm，呈二十面體對稱。根據(jù)病毒抗原性、基因組成不同?？蓪⑵浞譃?個基因型或稱血清型，即PCV1型和PCV2型。PCV1無致病性，PCV2具有致病性，是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndr

2、ome.PMWS)等相關(guān)疾病的主要病原。PCV2基因組全K1767bp或1768bp，包括11個讀碼框，其中ORF2編碼PCV2的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白，該蛋白具有較強的免疫原性，核苷酸序列同源性與PCV1相比僅為66％，與PCV1的血清沒有交叉反應(yīng)性，適合用于血清學的檢測，ORF2的特性使其能成為在分子水平上診斷PCV2的理想抗原。PCV2N端41個氨基酸與Cap蛋白的核內(nèi)定位密切相關(guān)，其中12～18位及34～41位的氨基酸對Cap蛋

3、白的核內(nèi)定位起著決定性作用。 根據(jù)PCV2-871病毒株的已知序列設(shè)計一對引物，PCR擴增其去核定位信號的ORF2基因，通過BamHI/HindⅢ雙酶切位點將其克隆到表達載體pQE-32中，予大腸桿菌M15中轉(zhuǎn)化。經(jīng)IPTG誘導表達、SDS-PAGE鑒定，表明去核定位信號的Cap蛋白可以大量表達，表達量占全菌體的55.9％。Westernblot、ELISA鑒定蛋白活性，結(jié)果表明：該蛋白具有良好的抗原活性。 本實驗中利用

4、原核表達的重組蛋白建立了瓊脂擴散實驗的檢測方法。根據(jù)可溶性抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在時，經(jīng)過一定時間在瓊脂凝膠上進行的沉淀反應(yīng)，抗原、抗體結(jié)合物形成白色絮狀沉淀，謂之沉淀線。可溶性抗原和抗體能在凝膠中自由擴散，二者在瓊脂凝膠中相遇，在比例最適處出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線(或稱沉淀帶)，該檢測方法確定了瓊脂板的最佳配制比例，進行了重復性、特異性的實驗，結(jié)果表明該方法具有良好的重復性、特異性，抗原應(yīng)用濃度在0.91～1.83mg/mL范圍之