豬圓環(huán)病毒2型LC株ORF2基因片段的原核表達及間接ELISA診斷方法的初步建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等相關疾病的主要病原。給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。了解PCV2的流行情況，可以給PCV2的預防和控制提供指導。豬圓環(huán)病毒ORF2基因編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap蛋白，該蛋白具有良好免疫原性。PCV1和PCV2 ORF2基因序列的核苷酸同源性僅為67％，兩種血清型的Cap蛋白雖存在共同的抗原決定簇，但兩者沒有抗原交叉性，因而是區(qū)分PCV1和PCV2的重要蛋白。

2、 根據(jù)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)LC株序列，設計合成5對引物，采用PCR方法從全序列重組質(zhì)粒PCV2-LC中擴增出了ORF2基因和4個不同長短ORF2基因片段，分別將其克隆到原核表達載體PET-32a上，經(jīng)酶切、序列測序正確后，再分別將各個重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用終濃度1mmol/L IPTG誘導，表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在。經(jīng)Western-Blot檢測表明，表達的重組蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能夠被PCV

3、2陽性血清所識別，具有良好的抗原性。用含有2mo l/L、4 mo l/L和8 mo l/L尿素的包涵體洗滌液多次洗滌溶解包涵體后，用Ni<'2+>親和層析柱對重組蛋白進行純化，獲得了理想的純化效果。 利用表達的重組融合蛋白ORF2c作為抗原，建立了檢測PCV2抗體的間接ELISA方法，并對ELISA的反應條件進行了摸索，確定了最適工作條件。結(jié)果表明，重組蛋白抗原的最適包被濃度為0.24μg/ml，最適包被條件為4℃過夜加37℃

4、2h，待檢血清的稀釋度為1:40，HRP-兔抗豬IgG的工作濃度為1:4000，待檢血清和酶標二抗的反應條件和反應時間均為37℃ 30min，底物室溫顯色15min，陰陽性臨界值為0.39。用建立的間接ELISA方法檢測了160份臨床血清樣品。并與市售的ELISA診斷試劑盒的檢測結(jié)果相比較，敏感性和特異性分別為90.4％和97.2％，總符合率達95％。兩種檢測方法的結(jié)果之間差異不顯著(P>0.05)。試驗表明，建立的間接ELISA檢測方