延邊流行株犬瘟熱病毒H基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus，CDV)感染而引起的急性傳染病，具有接觸性強(qiáng)、發(fā)病率和死亡率高等特點(diǎn)，并可引起機(jī)體免疫抑制，是危害犬科類動(dòng)物生命較為嚴(yán)重的傳染病之一，嚴(yán)重制約了我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)的發(fā)展。因此，建立一種快速、高效的特異性檢測(cè)方法對(duì)于該病的防控具有十分重要的意義。
　　本試驗(yàn)采集延邊地區(qū)自然感染犬瘟熱病毒患病犬的組織病

2、料，提取CDV全基因組，利用RT-PCR方法擴(kuò)增CDV-H基因，將其克隆至pMD18-T simple vector載體，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD18T-CDV-H，并將pMD18T-CDV-H與pGEX-4T-1載體經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-CDV-H，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)表達(dá)菌株，通過(guò)對(duì)不同溫度、IPTG濃度、Amp+濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件的優(yōu)化進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)，利用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)表達(dá)產(chǎn)物

3、進(jìn)行分離鑒定。將誘導(dǎo)表達(dá)出的重組蛋白進(jìn)行純化，利用Western-blot方法分析純化蛋白的反應(yīng)原性，并將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗CDV蛋白多克隆抗體，檢測(cè)其抗體效價(jià)，并利用純化抗原建立間接ELISA方法。
　　結(jié)果顯示，CDV-H基因全長(zhǎng)約為1824 bp，編碼607個(gè)氨基酸，該序列與近幾年GenBank中收錄的國(guó)內(nèi)外9株CDV-H基因核苷酸序列同源性為88.9-99.8％，氨基酸序列同源性為85.8-9

4、9.5％。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，重組融合蛋白的分子量約為103 Ku，以包涵體形式存在。純化蛋白經(jīng)Western-blot分析鑒定，具有良好的反應(yīng)原性，免疫BALB/c小鼠可誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗CDV-H抗體，抗體效價(jià)為1∶64，證明該重組表達(dá)蛋白具有良好的免疫原性。通過(guò)對(duì)間接ELISA方法最適條件的篩選，得到重組蛋白最佳包被濃度為6.88μg/mL，血清最佳稀釋度為1∶100，抗原最佳包被條件為4℃過(guò)夜，血清最佳作用條件為37℃1h，3％脫