雞空腸彎曲桿菌CadF蛋白的原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni，C.jejuni），是一種食源性致病菌，近年來，由其引發(fā)的食品安全問題日益突出。全世界每年有大約4-5億人感染該菌，主要臨床表現(xiàn)是以嘔吐、腹瀉癥狀的空腸彎曲桿菌腸炎，甚至繼發(fā)格林-巴利綜合征(Guillain-Barri syndrome，GBS)。開展流行病學(xué)調(diào)查并對該病進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測是有效控制該菌感染的根本途徑，一種快速、準(zhǔn)確、敏感性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)的檢測方法亟需建立。
　　本

2、研究以C.jejuni Q11株為研究對象，DNAStar軟件進(jìn)行序列分析并設(shè)計(jì)引物，PCR方法擴(kuò)增目的基因cadF，然后利用pET32a對cadF基因進(jìn)行原核表達(dá)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-CadF，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在37℃條件下，以1mmol/L IPTG對重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)后的重組蛋白通過SDS-PAGE及Westernblot進(jìn)行驗(yàn)證。SDS-PAGE分析表明，重組蛋白pET32

3、a-CadF分子量大小為53ku，以包涵體形式存在于沉淀中;Western blot分析表明，該蛋白可與空腸彎曲桿菌全菌陽性血清產(chǎn)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。
　　采用親和層析的方法對帶有His-Tag標(biāo)簽的蛋白進(jìn)行純化，以復(fù)性的蛋白作為抗原建立了檢測空腸彎曲桿菌血清的間接ELISA方法。對間接ELISA方法的條件進(jìn)行優(yōu)化，采用Cut-Off值法確定間接ELISA的陰陽臨界值。最終確定所建立方法的最佳條件是:在37℃條件下，

4、抗原包被濃度為1.05μg/mL;包被時(shí)間為2h;封閉條件為5％脫脂乳封閉1h;陽性血清稀釋倍數(shù)為1∶100，作用時(shí)間為45min;二抗作用濃度和時(shí)間分別為1∶5000、45min，顯色時(shí)間為10min，臨界值為0.339。利用大腸桿菌、沙門氏菌、多殺性巴氏桿菌等常見雞病的陽性血清驗(yàn)證所建立檢測方法的敏感性、批內(nèi)重復(fù)性及批間重復(fù)性驗(yàn)證對該方法的可重復(fù)性進(jìn)行了解，結(jié)果表明此方法具有良好敏感性、重復(fù)性及特異性;對血清樣品檢測表明:該方法可應(yīng)