豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)被公認(rèn)為在世界范圍養(yǎng)豬業(yè)中造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響的最重要的病毒之一。由于病毒、宿主的免疫力、混合感染情況和其他環(huán)境特征的差異，PCV2能引起不同的疾病，統(tǒng)稱為圓環(huán)病毒病(porcine circovirusdiseases, PCVDs)。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，PCVDs在我國(guó)一直呈上升趨勢(shì)，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。血清抗體的柃測(cè)常被用來(lái)分析PCV2的感染情

2、況以及評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果。ELISA因其敏感、特異、檢測(cè)快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用。然而研究表明，國(guó)內(nèi)檢測(cè)PCV2抗體的ELISA試劑盒普遍存在敏感性偏低的問(wèn)題，而進(jìn)口試劑盒因其價(jià)格昂貴，難于普及應(yīng)用。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、敏感、特異的診斷方法對(duì)于PCV2的預(yù)防和控制具有重要意義。
　　本研究利用PCR方法擴(kuò)增PCV2ORF2全長(zhǎng)基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-30a-Cap，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)。在SDS-

3、PAGE分析基礎(chǔ)上，結(jié)合ImageJ和Graphpadprism5.0軟件的分析，對(duì)影響重組Cap蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)起始OD600，IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等因素進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳表達(dá)條件為:當(dāng)菌體濃度達(dá)到1.0～1.5時(shí)，加入終濃度為0.2 mM的IPTG，37℃恒溫?fù)u床175 rpm振蕩培養(yǎng)5h。為得到高純度的重組Cap蛋白，對(duì)重組Cap蛋白純化條件進(jìn)行了探索，確定蛋白洗滌液中咪唑濃度為100mM，蛋白洗脫液中咪唑濃度為300

4、 mM。純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，重組Cap蛋白只與PCV2標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)，與E.coli BL21(DE3)陽(yáng)性血清和pET-30a/BL21(DE3)陽(yáng)性血清均不發(fā)生反應(yīng)，表明純化的重組Cap蛋白具有良好的特異性和反應(yīng)原性。
　　以純化的重組Cap蛋白為包被抗原，優(yōu)化試驗(yàn)條件，建立了PCV2 Cap-ELISA檢測(cè)方法:抗原包被條件為3μg/mL，4℃包被過(guò)夜;封閉液為5％馬血清+2.5％BD脫脂乳，37

5、℃封閉2 h;血清作用條件為200×，37℃孵育45 min;兔抗豬HRP-IgG稀釋度為5000×，37℃孵育45 min;顯色條件為37℃，15 min,利用TG-ROC方法確定臨界值為0.26即當(dāng)S/P≥0.26時(shí)，結(jié)果判定為陽(yáng)性;S/P＜0.26時(shí)，結(jié)果判定為陰性。該方法與PRV陽(yáng)性血清、TGEV陽(yáng)性血清、RV陽(yáng)性血清、PPV陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)。組裝的試劑盒的批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果變異系數(shù)分別為0.32％～7.8％和1.09％