豬圓環(huán)病毒2型的分離及其單克隆抗體的制備.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus2,PCV2）感染豬體通常引起豬的圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus-associated diseases,PCVAD)。這些疾病包括先天性震顫(congenitaltremors,CT)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatit

2、is and nephropathy syndrome,PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(porcinerespiratory disease complex,PRDC)、繁殖障礙(reproductivefailure)、肉芽腫性腸炎(granulomatous enteritis)等疾病，PCV2不斷出現(xiàn)新的基因型，難以得到及時有效地預(yù)防和控制，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
　　本實驗主要采集廣西省不同養(yǎng)殖場中疑似PCVAD感染豬只的

3、組織病料，旨在分離到PCV2，同時，分別以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PCV2 ORF2重組蛋白和PCV2為免疫原免疫小鼠，旨在獲得特異性針對PCV2的單克隆抗體，為PCV2診斷和疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。具體包含3方面的研究：
　　1.豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的分離鑒定
　　采集疑似PCVAD的病料81份，進(jìn)行DNA及RNA的提取，分別用常規(guī)PCR的方法鑒定PCV2、PPV1、PRV、CSFV病毒，選取PCV2條帶較亮，且無PPV1、

4、PRV、CSFV的病料用PK-15細(xì)胞進(jìn)行PCV2的分離。在PK-15細(xì)胞中盲傳5代后，用PCR的方法扔能檢測到PCV2，進(jìn)而通過PCV2全基因序列引物進(jìn)行全基因組測序，克隆入PMD-18T載體并進(jìn)行測序，序列分析顯示該毒株屬于PCV2為2d型。之后用IFA的方法也驗證了PCV2分離成功。
　　2.PCV2 ORF2重組蛋白和PCV2病毒的純化
　　將本實驗室構(gòu)建的表達(dá)PCV2 ORF2重組桿狀病毒AC-ORF2感染Sf9細(xì)

5、胞，進(jìn)而通過層析柱和超濾管濃縮的方法純化PCV2 ORF2重組蛋白，通過SDS-PAGE和BCA的方法檢測蛋白的純度和濃度，結(jié)果顯示濃度達(dá)到227.5μg/ml，另外，將PCV2感染PK-15細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后通過蔗糖密度梯度離心的進(jìn)行純化，熒光定量PCR測定PCV2拷貝數(shù)達(dá)到3.9*108， BCA方法測定PCV2的濃度達(dá)到251.6μg/ml。結(jié)果表明純化PCV2 ORF2重組蛋白和PCV2均達(dá)到小鼠免疫所用的抗原量，用于后期的研究。

6、
　　3.豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）單克隆抗體的制備
　　將PCV2 ORF2重組蛋白和PCV2病毒以50ug/只分別免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，三次免疫后，測定小鼠血清效價104以上，進(jìn)而取免疫后小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，并通過間接ELISA方法進(jìn)行篩選。3次亞克隆后獲得8株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為4C11，1H9，5B8，5C1，4F12（Cap蛋白免疫獲得）；4E12、4A8、3

7、E5（PCV2免疫獲得）。IFA和Western blot試驗說明，8株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體能與ORF2重組蛋白作用。特異性實驗表明，4F12、4E12株單抗與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2d）特異性反應(yīng)，經(jīng)抗體亞型鑒定1H9、4C11、5B8、5C14株亞型為IgG1/Kappa，4F12株為 IgG2b/Kappa，4E12、4A8、3E53株為IgM/Kappa，1H9、4C11、5B8、5C1、4F12、4E12、4A8、3E5株小鼠