豬圓環(huán)病毒2型ORF3、ORF4蛋白的檢測和功能研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科。主要編碼ORF1和ORF2兩大閱讀框。ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，ORF2構(gòu)成PCV2免疫相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白Cap。其中，Rep基因形成Rep和Rep’蛋白，兩者對病毒DNA的復(fù)制均是必須的。本研究檢測了PCV2上存在ORF3和ORF4蛋白，初步分析了它們的功能。
　　 以純化的重組ORF3、ORF4原核蛋白為免疫原，按常規(guī)方法免

2、疫BLAB/c小鼠制備單克隆抗體。取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，對雜交瘤細胞進行篩選，最終各獲得4株和6株持續(xù)穩(wěn)定分泌ORF3(1H3，3B1，3D12和3G7)和ORF4(2D3，1G12，2B8，4A4，4H4和6C6)單克隆抗體的雜交瘤細胞株?？贵w亞型鑒定表明，所有抗體的重鏈和輕鏈均分別為IgG，κ。以純化的原核蛋白免疫新西蘭兔，制備的抗ORF3和ORF4血清的瓊擴效價均達到1：64以上。ORF3、ORF4單克隆抗體和多克

3、隆抗體均能分別與PK—15細胞上表達的ORF3、ORF4蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 當PCV2病毒粒子感染PK—15細胞后，應(yīng)用RT—PCR和Northern blot技術(shù)分別能檢測到ORF3和ORF4編碼的mRNA在PK—15細胞上的轉(zhuǎn)錄。應(yīng)用制備抗ORF3豚鼠血清和抗ORF4兔血清能分別在PCV2感染的PK—15細胞內(nèi)檢測到ORF3和ORF4蛋白的存在，ORF3和ORF4蛋白主要表達在細胞核。這些數(shù)據(jù)分別從RNA和蛋白水平上

4、分別證明ORF3、ORF4基因在PCV2上的存在。
　　 將構(gòu)建的PCV2感染性克隆(pSK—PCV2)、ORF3(pSK—PCV2—m3)和ORF4(pSK—PCV2—m4)基因分別缺失的感染性克隆轉(zhuǎn)染PK—15細胞，48 h后用抗PCV2的ORF2蛋白單克隆抗體(單抗1C7)、ORF3豚鼠多克隆抗體和ORF4兔多克隆抗體進行免疫組織化學(xué)檢測，完整PCV2分子克隆均能產(chǎn)生ORF2、ORF3和ORF4蛋白， ORF3缺失的感染性

5、克隆僅能檢測到ORF2、ORF4蛋白，ORF4缺失的感染性克隆僅能檢測到ORF2、ORF3蛋白。拯救的病毒抗原在PK—15細胞上連續(xù)傳至第8代，ORF3缺陷型病毒從第一代的103.33TCID50/ml逐步增長至P8代的107.5TCID50/ml；ORF4缺陷型病毒從第一代的103.5TCID50/ml逐步增長至P8代的106.5 TCID50/ml。完整的PCV2感染性克隆病毒從P1代的103.5 TCID50/ml逐步增長至P8代