豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF4基因的表達(dá)、抗體的制備及檢測.pdf

1、目的:豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的一個(gè)主要病原，并與豬群中許多新發(fā)生的傳染病密切相關(guān)。在臨床上PCV2以仔豬呼吸急促困難、貧血、腹瀉、明顯的淋巴結(jié)病變、間質(zhì)性肺炎和進(jìn)行性消瘦為主要特征。當(dāng)前，PCV2在世界各國豬群中普遍存在并廣泛傳播，可引起豬的免疫抑制、混合感

2、染和繼發(fā)感染，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。PCV2已經(jīng)成為阻礙當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要病原之一。因此盡快揭開PCV2傳染和致病的機(jī)理就顯得相當(dāng)迫切。本研究擬在利用軟件分析PCV2 ORF4的基礎(chǔ)上，將ORF4分別克隆至原核和真核表達(dá)載體內(nèi)，表達(dá)得到ORF4融合蛋白并用純化的ORF4融合蛋白制備多克隆抗體，用抗體來檢測PCV2 ORF4基因在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　方法:首先通過NCBI Blast發(fā)現(xiàn)PCV2ORF4序列在不同毒株

3、間高度保守，設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)，以分離自臨床病料組織的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株(PCV2-SY)基因組為模板擴(kuò)增出ORF4的序列。酶切回收后和經(jīng)過相同酶雙酶切的載體pGEX-4T-1連接構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T-ORF4;并以pGEX-4T-ORF4為模板擴(kuò)增出GST-ORF4片段，雙酶切GST-ORF4片段和真核表達(dá)載體pPIC9K，然后將其連接構(gòu)建真核重組表達(dá)載體pPIC9K-GST-ORF4。以原核和真核表達(dá)載體表達(dá)的GST-O

4、RF4蛋白為抗原分別免疫新西蘭兔制備多克隆抗體。用制備的多克隆抗體對(duì)被PCV2感染后的不同時(shí)間的PK-15細(xì)胞進(jìn)行Western blot鑒定和免疫熒光測定，明確PCV2ORF4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了原核重組表達(dá)載體pGEX-4T-ORF4和真核重組表達(dá)載體pPIC9K-GST-ORF4，并通過PCR和測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行了鑒定，鑒定結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒符合要求，基因序列沒有發(fā)生突變。(2)在BL21細(xì)胞中成功表

5、達(dá)了ORF4融合蛋白GST-ORF4，SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果表明目的蛋白得到表達(dá)。(3)將線性化的pPIC9K-GST-ORF4電轉(zhuǎn)化進(jìn)入GS115細(xì)胞后，用PCR法和MD、MM平板法對(duì)重組表型進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果表明獲得的酵母重組子為Mut+表型，測序結(jié)果表明獲得的重組子基因序列完全正確，沒有突變。SDS-PAGE和Western blot鑒定結(jié)果表明酵母重組子在BMMY培養(yǎng)基中成功獲得了表達(dá)。(4)將純化后