豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF4基因的轉(zhuǎn)錄分析.pdf

1、Ⅱ型豬圓環(huán)病毒(PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的主要病原,同時(shí)與豬群中許多傳染病密切相關(guān),嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PCV2的致病機(jī)制目前仍不十分清楚,這與尚未有效篩選出與PCV2病原性相關(guān)的遺傳致病因子有很大的關(guān)系。PCV2基因組全長(zhǎng)1767～1768 bp,含有11個(gè)潛在的開(kāi)放閱讀框(ORFs)。目前,已知功能的閱讀框有3個(gè),ORF1編碼2個(gè)與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep和Rep'),ORF2編碼結(jié)構(gòu)蛋白(Cap),O

2、RF3編碼蛋白可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其它閱讀框是否編碼蛋白以及編碼蛋白有何功能仍不清楚,本研究擬在通過(guò)對(duì)PCV2 ORF3基因mRNA表達(dá)分析的基礎(chǔ)上,嘗試運(yùn)用熒光定量RT-PCR技術(shù)以及cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)對(duì)ORF4基因mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄檢測(cè)分析,為進(jìn)一步從蛋白水平研究檢測(cè)ORF4基因表達(dá)奠定基礎(chǔ),并最終為ORF4基因功能的研究提供新的研究方法和理論依據(jù)。<

3、br>　　 首先,設(shè)計(jì)一對(duì)PCV2全長(zhǎng)特異擴(kuò)增引物,引入便于后期基因操作的XbaⅠ酶切位點(diǎn),以分離自臨床病料組織的細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株(PCV2-SY)為模板,構(gòu)建了PCV2全長(zhǎng)分子克隆,對(duì)其基因組序列及主要的閱讀框ORF1、ORF2、ORF3和ORF4進(jìn)行了序列同源性比對(duì)和遺傳背景分析。其次,以測(cè)序的PCV2-SY毒株序列為參考,設(shè)計(jì)可特異擴(kuò)增ORF3基因以及同時(shí)擴(kuò)增ORF3和ORF4(ORF3+4)基因的引物,并以構(gòu)建的PCV2全長(zhǎng)分

4、子克隆為標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建可定量檢測(cè)ORF3基因以及ORF3+4基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的熒光定量RT-PCR體系;對(duì)體外培養(yǎng)PK-15細(xì)胞接毒后不同間隔時(shí)間內(nèi)病毒ORF3基因以及ORF3+4基因mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況進(jìn)行了定量分析,并在此基礎(chǔ)上對(duì)ORF4基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了定性分析。最后,通過(guò)3'RACE技術(shù)對(duì)ORF4基因mRNA3'末端poly(A)位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果如下:(1)PCV2-SY毒株基因組序列全長(zhǎng)1767 bp,為PCV2b亞型;與G

5、enBank已發(fā)表的PCV2毒株間的序列同源性介于95.4％～99.9％之間,并與中國(guó)江蘇安徽等地的分離株親緣關(guān)系最近;ORF4基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為98.3％～100.0％和95.0％～98.3％,不存在明顯的變異。(2)成功構(gòu)建可準(zhǔn)確定量比較OR-F3和ORF3+4基因mRNA表達(dá)差異的熒光定量RT-PCR體系,定量范圍為8×106～8×101拷貝數(shù)之間(R2＞0.99)。(3)在體外PCV2感染細(xì)胞中,不同時(shí)期O

6、RF3+4基因mRNA拷貝數(shù)均顯著高于ORF3基因(P＜0.05),間接說(shuō)明ORF4基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的存在,同時(shí)ORF3、ORF4基因mRNA可能存在不同的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。(4)通過(guò)3'RACE技術(shù)分別檢測(cè)到與ORF3和ORF4基因mRNA相關(guān)的poly(A)加尾位點(diǎn)。其中,ORF3基因mRNA相關(guān)poly(A)加尾位點(diǎn)位于編碼序列終止密碼子下游基因組第246堿基處;而ORF4基因mRNA相關(guān)poly(A)加尾位點(diǎn)位于基因組第1008堿基處,