豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF4表達缺失株的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、目的:豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV2)作為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的主要病原，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。同時，PCV2可能存在人畜共患病原的潛在威脅，但PCV2的致病機制目前仍不十分清楚。在PCV2分子致病機理研究中，已有3個開放閱讀框(ORFs)的功能得到驗證:ORF1表達Rep和Rep'兩個復(fù)制相關(guān)蛋白，參與病毒復(fù)制;ORF2表達病毒蛋白外殼;ORF3編碼蛋白參與病毒介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ORF4重疊于ORF3內(nèi)，其對于病毒致病機制

2、的功能尚不清楚。本研究通過構(gòu)建PCV2 ORF4表達缺失突變病毒，研究該蛋白于病毒復(fù)制和介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。同時，在本課題組前期工作確定ORF3/ORF4發(fā)生轉(zhuǎn)錄并獲得相關(guān)3' poly(A)加尾位點的基礎(chǔ)上，對ORF3/ORF4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5'端起始位點進行確認(rèn)，為ORF4基因功能研究奠定基礎(chǔ)，為研究PCV2致病機理提供新的研究方法和理論依據(jù)。
　　方法:首先，在課題組已獲得PCV2基因組全長序列的基礎(chǔ)上，對序列進行分析，選擇病毒

3、突變位點。通過起始密碼子突變和引入無義突變使突變后的閱讀框轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在蛋白翻譯過程中提前終止，從而無法產(chǎn)生有效蛋白。依據(jù)PCR定點突變試劑盒原理構(gòu)建突變體質(zhì)粒，經(jīng)酶切回收病毒基因組片段，在自環(huán)化反應(yīng)后轉(zhuǎn)染PK-15宿主細(xì)胞以產(chǎn)生突變病毒。產(chǎn)生的病毒通過檢測體外復(fù)制能力、RNA剪接和外殼蛋白的形成，最終確定重組及突變病毒的完整性和感染力。構(gòu)建了熒光定量檢測體系，并利用該體系檢測等拷貝數(shù)野生型、重組野生型和突變型病毒感染細(xì)胞后病毒DNA拷貝數(shù)

4、和ORF1、ORF3、ORF4 mRNA表達量差異，分析ORF4蛋白缺失對病毒復(fù)制的影響。在病毒感染細(xì)胞凋亡分析中，通過caspase家族活性檢測，檢測重組野生型和突變型病毒在病毒介導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能上的差異。最后，利用5' RACE技術(shù)對ORF4基因mRNA5'末端轉(zhuǎn)錄起始位點進行鑒定。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了具有體外感染能力的重組野生型和突變型病毒，并且突變病毒的突變位點在連續(xù)傳代第十五代病毒中仍然存在。(2)成功構(gòu)建了可用于

5、病毒滴度及多個ORF mRNA表達量測定的熒光定量檢測體系，定量范圍為2.53×102～2.53×107拷貝數(shù)之間(R2＞0.99)。(3)通過檢測等滴度野生型、重組野生型和突變型病毒感染細(xì)胞后病毒拷貝數(shù)和mRNA表達量上的變化，發(fā)現(xiàn)ORF4與病毒復(fù)制能力無關(guān)。同時各mRNA表達量檢測中發(fā)現(xiàn)，ORF4蛋白缺失不影響ORF4 mRNA表達。ORF4蛋白的缺失提高了ORF3的mRNA表達水平而參與病毒介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。同時，該蛋白缺失使病毒在