PCV2型流行毒株及其ORF3缺失表達(dá)的重組病毒構(gòu)建及特性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，其基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小為1767bp，無囊膜結(jié)構(gòu)，是最小的動(dòng)物病毒之一。PCV2能引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus-associate disease，PCVAD)，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。PCV2的ORF3蛋白已被證實(shí)與細(xì)胞凋亡和病毒的致病性有關(guān)。本研究旨在構(gòu)建新分離PCV2流行毒株的重組病毒及其不表

2、達(dá)ORF3的重組病毒，并分析它們的基本生物學(xué)特性，為后續(xù)深入開展致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.PCV2流行毒株的序列測(cè)定與分型
　　對(duì)上海某豬場(chǎng)PCV2流行毒株進(jìn)行分離和測(cè)序，并與上海周邊地區(qū)毒株序列進(jìn)行了比較，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明:該毒株為PCV2b型，與上海及周邊地區(qū)的毒株在同一個(gè)進(jìn)化分支，序列同源性在95％-99.9％。表明該地區(qū)流行的PCV2毒株為致病較強(qiáng)的PCV2b型。
　　2.重組病毒rPCV2-SH

3、和不表達(dá)ORF3的rPCV2-SHmuORF3的構(gòu)建
　　利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建了包括Cap重復(fù)序列的感染性克隆以獲得重組病毒rPCV2-SH，應(yīng)用點(diǎn)突變的方法構(gòu)建不表達(dá)ORF3的重組PCV2毒株rPCV2-SH-muORF3。將親本株rPCV2-SH和rPCV2-SHmuORF3體外盲傳14代后，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，病毒的TCID50分別為10-42/ml和10-39/ml(P＞0.05)，表明缺失ORF3的表達(dá)不影響病毒復(fù)制;熒

4、光定量PCR結(jié)果表明ORF3不表達(dá)后，病毒復(fù)制減慢，但與親本株相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.ORF3在PCV2致病中的作用
　　將親本株rPCV2-SH和rPCV2-SH-muORF3分別用MOI=1感染細(xì)胞36h，用TUNEL法測(cè)定細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果表明不表達(dá)ORF3的重組病毒細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于親本毒株(P＜0.01);6周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射105TCID50的親本株和突變株，接種后21天，病

5、理組織切片顯示親本株可引起明顯的淋巴結(jié)和脾臟的組織細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有淋巴細(xì)胞減少等病理變化;而ORF3缺失的重組病毒引起的病理變化相對(duì)比較輕。免疫組化結(jié)果也進(jìn)一步表明淋巴結(jié)和脾臟組織中親本株的病毒量要明顯高于ORF3不表達(dá)的重組病毒。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了PCV2流行毒株和不表達(dá)ORF3的重組病毒，初步證明ORF3在細(xì)胞凋亡中起一定作用，ORF3缺失不影響病毒復(fù)制。這些結(jié)構(gòu)為后續(xù)進(jìn)一步研究PCV2的復(fù)制和致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)