山東PCV2全基因序列分析及含CpG的PCV2ORF2的真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cricovirus type 2，PCV2)為無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒，屬圓環(huán)病毒科，與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post weaning multisystemicwasting syndrome，PMWS)密切相關(guān)，1991年在加拿大首次暴發(fā)，隨后世界許多國家和地區(qū)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 為了在分子水平上揭示山東PCV2流行的來源及遺傳學(xué)背景，并為山東省PCV2的防治提供一

2、種安全有效的手段，本研究在課題組對(duì)山東省PCV2血清學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)全基因序列(Gene bank accession number：40985(20))，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用PCR方法直接從在山東地區(qū)采集的血清學(xué)檢測(cè)為陽性的病料中分別擴(kuò)增出兩株P(guān)CV2毒株的全基因組，進(jìn)行了序列測(cè)定，分別命名為SD-1株(DQ346683)和SD-2株(DQ478947)，結(jié)果表明，SD-1株全基因

3、組核苷酸長(zhǎng)度為1767bp，SD-2株全基因組核苷酸長(zhǎng)度為1768 bp。應(yīng)用DNAstar分析表明，本實(shí)驗(yàn)得到的兩株P(guān)CV2的全基因序列與世界上其它地區(qū)的。PCV2分離株的全基因序列同源性高達(dá)93.9％-99.7％，ORF1基因序列的同源性為96.9％-99.7％，ORF2基因序列的同源性為91.2％-99.9％。 以PCV2 SD1株(DQ346683)的DNA為PCR模板，擴(kuò)增得到編碼PCV2結(jié)構(gòu)蛋白的ORF2基因，在課題

4、組對(duì)適合豬的CpG-ODN篩選研究的基礎(chǔ)上，將ORF2基因和一段含有18個(gè)CpG基序的150bp長(zhǎng)的CpG序列分別插入了真核表達(dá)載體pVAX1的多克隆位點(diǎn)和骨架結(jié)構(gòu)中，得到了重組真核表達(dá)載體pVAX1-ORF2-CpG，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中對(duì)ORF2基因進(jìn)行了體外表達(dá)試驗(yàn)，用間接免疫熒光方法對(duì)表達(dá)蛋白的免疫原性進(jìn)行了初步檢測(cè)。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的含CpG的PCV20RF2的真核表達(dá)載體pVAX1-ORF2-CpG在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到成功