PRRSV ORF5與PCV2 ORF2真核表達載體的構(gòu)建和PRRSV變異株的分離及序列分析.pdf

1、為了研究病毒編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并為山東省PRRS及PCV的防治提供一種理論和實際依據(jù)，本研究對PRRSV SD1株的ORF5和PCV SD2株的ORF2進行了測序，根據(jù)哺乳動物細胞真核表達載體pIRES MCSA MCSB多克隆位點的序列和PRRSV SD1株ORF5和PCV SD2株的ORF2基因閱讀框架，同時考慮外源基因的表達量在基因起始密碼子的前面加入Kozak序列，分別設(shè)計了針對ORF5、ORF2的引物Y1/Y2，H1

2、/H2。將PCR產(chǎn)物ORF2經(jīng)雙酶切回收后插入真核表達載體pIRES得到pIRES-ORF2，RT-PCR產(chǎn)物ORF5經(jīng)雙酶切回收后插入pIRES-ORF2構(gòu)建成重組質(zhì)粒pIRES-ORF2/ORF5。經(jīng)PCR、RT-PCR、雙酶切及測序鑒定，證明成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pIRES-ORF2/ORF5。 將構(gòu)建成功的pIRES-ORF20RF5重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染真核細胞Marc-145，經(jīng)G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞株，以P

3、CR、RT-PCR、和間接免疫熒光檢測目的蛋白的表達情況。結(jié)果表明：經(jīng)PCR、RT-PCR檢測到兩種目的基因的轉(zhuǎn)錄；間接免疫熒光試驗檢測到目的蛋白在細胞漿和細胞核中觀察到了特異性的亮綠色熒光，證明蛋白得到表達。 首次在國內(nèi)將PRRSV ORF5與PCV2 ORF2同時插入哺乳動物細胞真核表達載體并進行成功表達，為構(gòu)建PRRSV與PCV雙基因真核表達載體的研究提供思路和依據(jù)。 從2006年6月份開始，我國南方暴發(fā)了嚴(yán)重的豬

4、”高熱病”，目前已造成上千萬頭豬只的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失。山東省于2006年12月份開始暴發(fā)此病。通過細胞中傳代培養(yǎng)，分離出2株變異毒株，通過RT-PCR技術(shù)從中擴增出PRRSV ORF5片段，并測其序列。應(yīng)用DNASTAR、DNAMAN序列分析軟件對所測的2株序列與北美洲原型(VR-2332株)、歐洲原型(LV株)和部分國內(nèi)外分離株的相應(yīng)片段進行核苷酸同源性比較，差異較大，均為強毒株。從而為山東地區(qū)無名高熱PRRSV的控制及疫