PRRSV ORF5 與ORF6基因重組改良型痘苗病毒安卡拉株的免疫效力研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種以妊娠母豬嚴重繁殖障礙，仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRSV對豬肺泡巨噬細胞有嚴格嗜性，抗原性極易發(fā)生變異，以至于出現(xiàn)了目前流行的變異株。目前用于預(yù)

2、防PRRS的疫苗主要是傳統(tǒng)的弱毒苗和滅活苗，但已證實弱毒苗存在散毒及高幾率毒力返強的安全隱患，許多國家已經(jīng)禁止使用弱毒苗；滅活苗安全性雖好，但需多次接種，而且免疫效果不確實，還經(jīng)常導致免疫失敗。因此，研究安全、高效、廉價的新型疫苗來防制PRRS具有十分重要的意義。
　　 改良型痘苗病毒安卡拉株（Modified vaccinia virus ankara，MVA）被認為是最具潛力的病毒我體之一，重組MVA能夠模仿體內(nèi)病毒感染的過

3、程，向機體的免疫系統(tǒng)提供“危險信號”。MVA的生活周期允許疫苗抗原在感染細胞的細胞漿中合成，對抗原分子向MHC-Ⅰ類分子有效遞呈，引發(fā)特異性CD8+T細胞反應(yīng)特別有利。與復(fù)制型痘苗病毒不同，MVA的宿主范圍很窄，對人類及其他哺乳動物僅產(chǎn)生一過性感染，接種后的副反應(yīng)小。因此，許多利用MVA作載體的試驗性疫苗已經(jīng)在動物模型中顯示了良好的保護性體液免疫與細胞免疫反應(yīng)。也正是由于MVA載體具有的這些優(yōu)點，使其從眾多的活病毒載體中脫穎而出，成為當

4、前重組病毒活載體疫苗研究的熱點。本研究以PRRSV兩個最主要的保護性抗原基因-ORF5及ORF6為目標基因，以MVA為載體對共表達PRRSV修飾的GP5與M蛋白的重組MVA的免疫效力進行了研究，主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.共表達PRRSV GP5與M蛋白的重組MvA的免疫效力研究
　　 本研究以MVA為載體構(gòu)建了4個以不同方式表達PRRSV GP5與M蛋白的重組病毒一在兩個啟動子下共表達GP5與M蛋白（rMVA-GP5

5、/M）、在一個啟動子下融合表達GP5與M蛋白（rMVA-GP5-M）及單獨表達GP5與M蛋白（rMVA-GP5與rMVA-M），利用Balb/C小鼠檢測4個重組病毒引發(fā)的體液免疫與細胞免疫反應(yīng)。重組病毒以5×105TCID50/只的劑量肌肉注射試驗小鼠，每組20只，在3周后加強免疫，利用微量中和試驗檢測中和抗體滴度以評價小鼠的體液免疫反應(yīng)；利用商品化ELISA試劑盒檢測γ-IFN，IL-2、IL-4的產(chǎn)量，以衡量小鼠的細胞免疫反應(yīng).結(jié)果

6、表明，rMVA-GP5/M免疫組產(chǎn)生了最高滴度的中和抗體與最強烈的Th1型細胞免疫反應(yīng)，rMVA-GP5-M免疫組所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)較rMVA-GP5/M免疫組弱，但是優(yōu)于rMvA-GP5與rMVA-M免疫組，rMVA-GP5與rMVA-M不能產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)。
　　 2.PRRSV GP5“A”表位的修飾與糖基化位點的突變對其免疫效力的影響
　　 為了提高PRRSV ORF5基因的免疫效力，對ORF5基因進行修飾。一方

7、面，將CpG序列和通用型輔助性T淋巴細胞表位插入“A”表位與“B”表位之間，另一方面，對N33與N51位糖基化位點進行了點突變，獲得修飾的ORF5（MORF5）。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了由兩個CMv啟動子調(diào)控的共表達MGP5與M蛋白的真核重組質(zhì)粒pcDNA-M5A-6A。經(jīng)western-blot與IFA驗證真核質(zhì)粒的體外表達后，以101μg/只的劑量免疫6周齡Balb/c小鼠，每組20只，在3周后加強免疫，利用微量中和試驗檢測免疫后的中和抗體

8、，利用商品化ELISA試劑盒檢測免疫小鼠脾臟淋巴細胞分泌γ-IFN、IL-2及IL-4的能力，并與含有野生型ORF5的真核重組質(zhì)粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及滅活疫苗進行比較。結(jié)果表明，pdDNA-M5A-6A不但能夠刺激免疫小鼠在較短的時間內(nèi)產(chǎn)生更高水平的中和抗體，而且可以誘導產(chǎn)生更強烈的細胞免疫應(yīng)答。
　　 3.改良型痘苗病毒安卡拉株表達系統(tǒng)的改造
　　 柵究利用Cre/LoxP系統(tǒng)及表達Cre重組酶的BHK

9、-21細胞系（BHK-Cre），以大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Eco gpt）為篩選標記構(gòu)建最終可以刪除標記基因的新型轉(zhuǎn)移載體。將Eco gpt基因以及調(diào)控其表達的啟動子基因（P7.5+Eco gpt）置于兩個同向LoxP位點之間，多克隆位點位于兩個同向LoxP位點之外。改造后的載體可以同時表達兩個外源基因，重組病毒可以利用BHK-Cre刪除篩選標記Eco gpt。
　　 4.共表達PRRSV修飾的GP5與M蛋白的重組

10、MVA的構(gòu)建及其生物學特性
　　 將PRRSV修飾的ORF5（MORE5）與ORF6基因分別克隆入經(jīng)改造的MVA轉(zhuǎn)移載體pLR-gpt的兩個多克隆位點中，構(gòu)建MVA重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLR-MORE5/ORF6。經(jīng)脂質(zhì)體介導，將構(gòu)建好的pLR-MORE5/ORF6轉(zhuǎn)染已感染親本MVA2h的BHK-21細胞單層，用藥物選擇性培養(yǎng)基（MXHAT）在24孔板上進行連續(xù)篩選純化，得到帶有篩選標記的重組病毒rMVAgpt-MGP5/]M。將rM

11、VAgpt-MGP5/M感染BHK-Cre，獲得刪除篩選標記的重組病毒rMVA-MGP5/M。PCR證明MORF5與ORF6基因成功的插入MVA基因組中；Western-blot檢測與IFA證明重組病毒能正確表達MGP5與M蛋白；重組病毒與親本MVA出現(xiàn)病變的時間及病毒滴度基本達到一致。以上結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建了刪除篩選標記的共表達PRRSV MGP5與M蛋白的重組MVA，并且表達產(chǎn)物具有免疫原性；外源基因的插入不影響MVA的復(fù)制，

12、具較好的穩(wěn)定性.
　　 5.共表達PRRSV修飾的GP5與M蛋白的重組MVA對豬的免疫效力研究
　　 為了檢測rMVA-GP5/M對豬的免疫效力，將4周齡的健康仔豬隨機分為6組，每組10頭，設(shè)rMVA-MGP5/M（Ⅰ）、pcDNA-M5A-6A（Ⅱ、Ⅲ）與滅活疫苗（Ⅳ）4個免疫試驗組，同時設(shè)立MVA親本毒接種對照組（Ⅴ）及PBS空白對照組（Ⅵ）.肌肉注射免疫，重組質(zhì)粒的免疫劑量為200μg/頭，重組病毒免疫組與親本毒對

13、照組免疫劑量為5×103TCID50/頭，滅活苗免疫組按照使用說明進行，空白對照組每頭注射2mL高壓滅菌的PBS，4周后進行加強免疫，其中第Ⅲ組改用重組病毒免疫。首次免疫后每隔2周無菌采血，分離血清，利用細胞中和試驗檢測PRRSV特異性中和抗體水平；在首次免疫后30、50與70天，無菌采血，分離血液中的淋巴細胞，用PRRSV抗原刺激后檢測其分泌PRRSV特異性細胞因子的水平。結(jié)果表明，加強免疫后2周，DNA→rMVA免疫組與rMVA→r

14、MVA免疫組都產(chǎn)生了可檢測到的中和抗體，DNA→DNA在加強免疫后4周檢測到中和抗體.在整個試驗過程中，DNA→rMVA免疫組中和抗體水平最高.就細胞免疫反應(yīng)而言，初次免疫后30天，各試驗組細胞因子的產(chǎn)量沒有明顯差異；在初次免疫后50天，與親本MVA及PBS對照組相比，3個試驗組γ-IFN與IL-2的產(chǎn)量明顯增多，與中和抗體的變化相一致的是DNA→rMVA免疫組的細胞因子（γ-IFN與IL-2）產(chǎn)量最高，與rMVA→rMVA免疫組及DN