PRRSV貴州株ORF5基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其變異的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以成年母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為主要特征的高度接觸性傳染病，該病已成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。盡管目前預(yù)防該病的滅活疫苗和弱毒疫苗已經(jīng)研制出來(lái)，但應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，其安全性和有效性等方面都存在著很多質(zhì)疑，并且免疫效果不佳，因此研發(fā)基因工程疫苗防制豬繁殖與呼吸綜合征勢(shì)在必行。同時(shí)近年來(lái)的研究表明，PRRSV流行毒株存在廣泛的變異現(xiàn)象，同一基因型的分離毒株之間存在

2、明顯的序列差異，特別是在基因組ORF1a的NsplB和Nsp2、ORF3和ORF5的變異性很大，由此可見(jiàn)，了解 PRRSV的基因變異對(duì)于基因工程疫苗的研究有重要的參考價(jià)值。
　　本研究參考 GenBank上發(fā)表的豬繁殖與呼吸綜合征病毒貴州分離株(PRRSV Guizhou-1,基因編號(hào) EU259060)核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，將實(shí)驗(yàn)室分離保存的豬繁殖與呼吸綜合征病毒貴州株(PRRSV Guizhou-1)接種于Marc-

3、145細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變（CPE）后，收集細(xì)胞懸液，用Trizol試劑提取總 RNA并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：42℃30min RT反應(yīng)；94℃2min，94℃30ｓ，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min，結(jié)果獲得大小約750bp的目的DNA條帶，與預(yù)期大小相符。回收純化擴(kuò)增的目的DNA條帶后，將其連接于質(zhì)粒 pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 Top10細(xì)胞中，提取陽(yáng)性質(zhì)粒 DNA并酶切

4、鑒定后，將目的DNA分別克隆于原核表達(dá)載體 pET32a(+)和真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)中，并分別轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞 BL21和Top10中，通過(guò)抗性篩選、酶切鑒定和序列測(cè)定證明原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，該研究為進(jìn)一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒貴州株（Guizhou-1） ORF5基因的體外表達(dá)、開(kāi)發(fā)新型診斷試劑盒和新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　PRRSV貴州株 ORF5基因變異的研究是通過(guò)采集2007年貴州省16家

5、規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)153份疑似 PRRS豬臨床材料，分別采用金標(biāo)卡、ELISA和RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為金標(biāo)卡抗體檢測(cè)陽(yáng)性病料64份，ELISA抗體檢測(cè)陽(yáng)性病料54份，RT-PCR陽(yáng)性病料28份。測(cè)序結(jié)果分析表明：所有 RT-PCR陽(yáng)性病料 ORF5基因核苷酸序列的同源性為98.7％～100％，氨基酸序列同源性為98.5％～100％，與美洲型代表毒株 VR-2332、國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)毒株CH-1a和歐洲型代表毒株 LV基因核苷酸序列的同源性分別為

6、89.2％～90％、94.8％～95.6％、59.7％～60.2％，氨基酸序列同源性分別為88.8％～89.3％、92.7％～94.2％、54.9％～55.3％。遺傳衍化關(guān)系分析表明貴州流行毒株屬于美洲型，ORF5基因發(fā)生離散性變異可以分為三個(gè)簇（Ⅱ簇，Ⅲ簇，Ⅵ簇），與我國(guó)其他地區(qū)分離高致病性 PRRS病毒關(guān)系密切，而與早期分離的PRRS毒株關(guān)系疏遠(yuǎn)，結(jié)果表明貴州省豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因存在變異現(xiàn)象，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為貴州省豬繁殖與呼吸