Orf25基因表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本研究以煙草品種“MS中煙90”和“MS革新3號”為受體材料，分別采用組成型啟動子CaMV35S和花特異啟動子PchsA構(gòu)建Orf25基因植物表達(dá)載體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)Orf25基因遺傳轉(zhuǎn)化法，進(jìn)一步探索并優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系。為Orf25基因功能驗證及其對煙草雄性不育系和相應(yīng)可育系的差異的研究提供基礎(chǔ)材料和方法，以期探討已克隆的煙草雄性不育相關(guān)基因Orf25的功能及其在煙草雄性不育形成中的作用，為揭示煙草雄性不育的分

2、子機(jī)理、深化煙草雄性不育雜種優(yōu)勢利用的理論和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、以實驗室保存的pUC57-Orf25為模板，酶切回收目的基因Orf25后與同樣雙酶切的表達(dá)載體pBI121連接，獲得新的表達(dá)載體pBI121-Orf25，同時，進(jìn)一步將表達(dá)載體pBI121-Orf25中的啟動子CaMV35S換成花特異啟動子PchsA，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-PchsA-Orf25，并將表達(dá)載體pBI121-Orf25（含C

3、aMV35S啟動子）和pBI121-PchsA-Orf25分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，為下一步進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)Orf25基因的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。
　　2、優(yōu)化了煙草組織培養(yǎng)體系：煙草最佳分化愈傷或不定芽的分化培養(yǎng)基是MS+1.0mg/L6-BA+0.1NAA；煙草不定芽最佳生根培養(yǎng)基是純MS培養(yǎng)基。
　　3、優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草Orf25基因遺傳轉(zhuǎn)化體系：用稀釋100倍的農(nóng)桿菌菌液（OD600為0.5）侵染經(jīng)預(yù)培養(yǎng)3

4、天后的外植體8分鐘，接種到最佳分化培養(yǎng)基中共培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)接到含80mg/L卡那霉素和500mg/L氨芐青霉素的選擇分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化不定芽，等不定芽生長到2cm左右后轉(zhuǎn)接到含80mg/L卡那霉素和500mg/L氨芐青霉素的篩選生根培養(yǎng)基中。
　　4、抗性植株的篩選及PCR檢測：轉(zhuǎn)pBI121-CaMV35S-Orf25基因煙草植株總DNA與pBI121-CaMV35S-Orf25陽性質(zhì)粒DNA擴(kuò)增出的片段大小一致，約為494b

5、p的特異性條帶，轉(zhuǎn)pBI121-PchsA-Orf25基因煙草植株總DNA與pBI121-PchsA-Orf25陽性質(zhì)粒DNA擴(kuò)增出的片段大小一致，約為480bp的特異性條帶，非轉(zhuǎn)基因植株陰性對照沒有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。共獲得52株轉(zhuǎn)pBI121-CaMV35S-Orf25基因煙草植株和76株轉(zhuǎn)pBI121-PchsA-Orf25基因煙草植株，經(jīng)鑒定：其中轉(zhuǎn)pBI121-CaMV35S-Orf25基因陽性植株有14株，轉(zhuǎn)化率為26.9％；轉(zhuǎn)p