抗蟲基因植物表達(dá)載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化及表達(dá)研究.pdf

1、本研究在王彥平構(gòu)建的植物表達(dá)載體基礎(chǔ)上構(gòu)建Bt抗蟲基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化煙草，對Bt基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測。試驗進(jìn)一步以普通741楊和轉(zhuǎn)雙抗蟲基因pB29無菌苗為試驗材料，建立了葉片再生體系并對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt cry3A(Bt3)基因轉(zhuǎn)入已含Bt cry1A?(Bt1)基因的pB29中，獲得轉(zhuǎn)雙Bt基因741毛白楊，對部分轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了DNA水平和蛋白質(zhì)水平的檢測。主要研究結(jié)果如下：
　　

2、 利用植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3，通過DNA重組技術(shù)，分別將Bt1和Bt3基因正向插入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301中，成功構(gòu)建了pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3植物表達(dá)載體。此可讀框架通過組成型啟動子CaMV35S啟動，攜帶PPT乙酰基轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因作為選擇標(biāo)記基因，并將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA10

3、5。
　　 確定煙草轉(zhuǎn)化的潮霉素臨界篩選濃度為50 mg.L-l，頭孢噻肟鈉的抑菌濃度為200 mg.L-l。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將植物表達(dá)載體載體pCAMBIA1305-Bt1-Bt3、pCAMBIA1305-Bt1和pCAMBIA1305-Bt3及構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Bt1、pCAMBIA3301-Bt3轉(zhuǎn)入煙草中，均得到完整再生植株。經(jīng)PCR檢測，初步證明目的基因已整合到煙草的基因組中。ELISA檢測表

4、明，大部分轉(zhuǎn)基因株系中Bt1和Bt3毒蛋白表達(dá)量均高于對照。在5株攜帶雙價Bt基因的轉(zhuǎn)基因煙草中，Bt1毒蛋白和Bt3毒蛋白的表達(dá)量最高分別達(dá)0.030 1％和0.293 8％。
　　 對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的741楊遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，確定葉片誘導(dǎo)分化不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg.L-l+NAA 0.1 mg.L-l，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1 mg.L-l。潮霉素臨界篩選濃度為10 mg.L-l，

5、抗生素頭孢噻肟鈉的抑菌濃度為400 mg.L-l。遺傳轉(zhuǎn)化的適宜菌液濃度為OD600=0.4，浸菌時間為8～10 min，共培養(yǎng)時間以2 d為宜。
　　 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將Bt3基因轉(zhuǎn)入已轉(zhuǎn)Bt1基因的雜種741毛白楊無性系pB29中，獲得轉(zhuǎn)雙Bt基因741毛白楊。在含Hyg的培養(yǎng)基中進(jìn)行多次繼代篩選，獲得抗性穩(wěn)定的無性系9個，編號為pC1～pC9。
　　 采用特異引物分別對獲得的轉(zhuǎn)雙Bt基因741楊無性系進(jìn)行PCR檢

6、測，結(jié)果表明：Bt1基因穩(wěn)定存在于pB29無性系中，Bt3基因已整合到各無性系的基因組DNA中。對雜種741毛白楊轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行毒蛋白表達(dá)的ELISA檢測，結(jié)果表明，所選轉(zhuǎn)雙價Bt基因的741楊的2個無性系pC1和 pC2，均檢測到Bt1和Bt3毒蛋白的表達(dá)。Bt1毒蛋白的表達(dá)量分別為0.009 4％和0.011 0％；Bt3毒蛋白的表達(dá)量分別為0.217 0％和0.149 4％，高于對照pB29及轉(zhuǎn)單一Bt3基因的741楊無性系CC71