植物甜蛋白基因Thaumatin表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)雪蓮果的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、甜蛋白(Thaumatin)存在于西非熱帶雨林中一種竹芋科多年生草本(Thaumatococcus daniellii Benth)的果實(shí)膠質(zhì)假種皮中。Thaumatin蛋白有甜味,而且它還具有低熱量、安全無(wú)毒、甜味純正及可被降解為體內(nèi)所需氨基酸等優(yōu)點(diǎn),是一類高甜度而又不含糖的新型甜味劑,所以它被認(rèn)為有希望發(fā)展成為食品工業(yè)中營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物的替代品而成為未來(lái)新型的甜味劑。但是T.daniellii在原產(chǎn)地之外不能正常結(jié)實(shí),并且引種不成功

2、難以大量生產(chǎn),致使甜味蛋白成為十分昂貴的商品。生物技術(shù)的迅速發(fā)展啟發(fā)人們用基因重組的手段開(kāi)發(fā)甜蛋白,對(duì)這些甜味蛋白和矯味蛋白進(jìn)行了克隆和測(cè)序,并將其表達(dá)于其他宿主。已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了甜蛋白在微生物中的表達(dá),個(gè)別的還在一些植物中得到表達(dá)。因此,本試驗(yàn)在吸取前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-Thaumatin,并將其轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中,然后通過(guò)農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將Thaumatin基因?qū)胙┥徆?并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了檢測(cè),借以

3、初步探討甜蛋白在植物中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況,為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化園藝植物打下了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 (1)甜蛋白Thaumatin基因的人工合成和克隆本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已報(bào)道的Thaumatin基因序列,采用重疊延伸-PCR法人工合成Thaumatin全長(zhǎng)基因,與T載體pMD19-T連接后轉(zhuǎn)化DH5α,通過(guò)菌落PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定,得到克隆載體pMD-Thaumatin。
　　 (2)甜蛋白Thaumatin基因植物表達(dá)質(zhì)粒pB1

4、121-Thaumatin的構(gòu)建與鑒定。
　　 利用DNA重組技術(shù),將植物甜蛋白Thaumatin基因克隆至植物表達(dá)載體pB1121中,通過(guò)PCR、酶切、電泳鑒定Thaumatin基因已成功構(gòu)建到植物表達(dá)質(zhì)粒pB1121中。
　　 (3)pB1121-Fhaumatin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒pB1121-Thaumatin通過(guò)直接轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中,利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)平板篩選陽(yáng)性克隆,有

5、單菌落生長(zhǎng),經(jīng)過(guò)菌液PCR鑒定,證明重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)進(jìn)農(nóng)桿菌EHA105中。
　　 (4)植株再生體系的建立采用無(wú)菌苗雪蓮果(Smallanthus sonchifolius)葉片為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基,篩選出MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L,形成愈傷組織,MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L以誘導(dǎo)不定芽的分化,并于1/2MS+NAA0.2mg/L生根培養(yǎng),獲得完整再生植株。
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