Marker-free轉(zhuǎn)基因番茄表達(dá)外源植物甜蛋白ThaumatinⅡ.pdf

1、番茄(Solanum lycopersicum L.)是最重要的蔬菜作物之一,隨著番茄遺傳學(xué)研究和國(guó)際茄科基因組計(jì)劃(International Solanaceae Genome Projiect,SOL)的發(fā)展,番茄己成為轉(zhuǎn)基因研究的理想模式植物。植物甜蛋白Thaumatin甜度高、甜味純、熱量低、口感好、無(wú)毒害,被消化后可降解為人體所需的各種氨基酸,具有增進(jìn)或改善食品風(fēng)味的功能。選擇番茄作為生物反應(yīng)器來(lái)生產(chǎn)ThaumatinⅡ有著

2、巨大的商業(yè)潛力:首先容易實(shí)現(xiàn)外源目的基因的轉(zhuǎn)化;其次,外源基因的成功轉(zhuǎn)入可以提高番茄果實(shí)甜味、改善果實(shí)品質(zhì);第三,借助番茄的高產(chǎn)量進(jìn)行大量、低成本地生產(chǎn)ThaumatinⅡ甜蛋白,降低了ThaumatinⅡ食品添加劑成本。本文擬以番茄為材料通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將ThaumatinⅡ基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入番茄,從而提高番茄的果實(shí)品質(zhì)。本論文的研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.通過(guò)對(duì)分化和生根培養(yǎng)基的篩選,我們建立了高效的番茄再生體系。統(tǒng)

3、計(jì)結(jié)果表明0.2mg/L ZT和1.0mg/L IAA配組時(shí)分化再生效率最高,而且NAA為0.05mg/L時(shí)生根效果最好;
　　 2.以番茄的無(wú)菌苗子葉為外植體,以抗卡那霉素的NTPⅡ作為選擇標(biāo)記基因,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將甜蛋白ThaumatinⅡ基因?qū)敕阎?共獲得了10株獨(dú)立的抗性轉(zhuǎn)化株系;
　　 3.對(duì)獲得的10株獨(dú)立的T0抗性轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行PCR鑒定,10個(gè)轉(zhuǎn)化株系PCR都檢測(cè)得到預(yù)期的特異條帶;進(jìn)一步采用S

4、outhern雜交對(duì)其中T0代的Thau-10轉(zhuǎn)化株進(jìn)行插入確認(rèn);
　　 4.將獲得轉(zhuǎn)基因T1的Thau-2和Thau-4種子播種到含有200mg/L Kan的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行遺傳特性分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系Thau-2及Thau-4抗性植株和非抗性植株比例均接近3:1,推測(cè)兩個(gè)株系均為單拷貝插入;
　　 5.不同濃度β-estradiol(雌二醇)分別處理T0真葉和T1無(wú)菌苗誘導(dǎo)分化Marker-free苗,初步