影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因表達(dá)的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TF)是體內(nèi)鐵離子運(yùn)輸?shù)妮d體，對(duì)于個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育有很重要作用，因此運(yùn)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白具有很好的臨床價(jià)值和經(jīng)濟(jì)前景。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞水平和個(gè)體水平研究證明了基因的甲基化影響外源基因hTF表達(dá)水平，并初步探討了這一表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步提高h(yuǎn)TF的表達(dá)水平提供理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增了兔TF啟動(dòng)子（RP)啟動(dòng)hTF表達(dá)的重組載體，并純化了該質(zhì)粒載體,細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明，在BRL-3A（大鼠肝

2、臟細(xì)胞系）和HC-11（小鼠乳腺上皮細(xì)胞系）中，RP啟動(dòng)子可以高效啟動(dòng)外源基因hTF的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步得到了兩個(gè)穩(wěn)定表達(dá)hTF的BRL-3A細(xì)胞克隆，使用5-雜胞苷（5-aza-dC）處理兩個(gè)穩(wěn)定克隆發(fā)現(xiàn)，5-aza-dC可以明顯提高外源基因hTF的表達(dá)水平，且提高程度與5-aza-dC的用量成正比，說(shuō)明在細(xì)胞水平外源基因hTF的表達(dá)受到甲基化的調(diào)控。兩個(gè)細(xì)胞克隆表達(dá)hTF的能力不同，相差一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且使用相同濃度的5-aza處理兩個(gè)

3、克隆，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)克隆外源基因的表達(dá)升高程度不一樣，提示外源基因的表達(dá)除了受甲基化影響，還受到如整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)等因素影響。 本實(shí)驗(yàn)為了在個(gè)體水平探討hTF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，使用慢病毒感染制備得到了一批表達(dá)水平各異的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)定量PCR的方法，鑒定并得到了一批單位點(diǎn)單拷貝的F1代轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)分析三只小鼠F1-797，F(xiàn)1-949和F1-972的心，肝，脾，肺，腎，腦，睪丸，肌肉八種臟器hTF的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，RP啟動(dòng)子啟動(dòng)h

4、TF表達(dá)具有組織傾向性，在肝臟和腦中hTF表達(dá)較高，肌肉表達(dá)較低。進(jìn)一步分析了F1-797和F1-949小鼠的肝臟，心臟和肌肉的hTF轉(zhuǎn)錄水平和其RP啟動(dòng)子的甲基化程度發(fā)現(xiàn)，表達(dá)hTF最強(qiáng)的肝臟，其啟動(dòng)子甲基化程度最低，幾乎不表達(dá)hTF的肌肉，其啟動(dòng)子幾乎完全甲基化，心臟表達(dá)hTF 中等，甲基化程度也中等。也就是說(shuō)，hTF轉(zhuǎn)錄水平與其啟動(dòng)子甲基化程度呈負(fù)相關(guān)。 另外對(duì)F1-797，F(xiàn)1-949和F1-972小鼠的肝臟中hTF的

5、表達(dá)水平和啟動(dòng)子的甲基化的分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)hTF的F1-797和F1-949，其肝臟外源基因啟動(dòng)子低甲基化，中表達(dá)hTF的F1-972小鼠，其肝臟外源基因啟動(dòng)子甲基化程度要略高一些。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，hTF的轉(zhuǎn)錄水平與啟動(dòng)子的甲基化程度是負(fù)相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)最后還分析了每一個(gè)CpG雙聯(lián)體在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。數(shù)據(jù)顯示，hTF表達(dá)越高，RP的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)PRI，RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)以及KOZAK序列的CpG雙聯(lián)體表現(xiàn)出低于平均水平