轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因整合位點(diǎn)的分析.pdf

1、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、環(huán)境等各個(gè)方面都具有廣闊的發(fā)展前景。自從1974年Jaenisch等把猿猴空泡病毒(SV40)的DNA注射入小鼠胚泡，培養(yǎng)出具有猿猴空泡病毒轉(zhuǎn)基因小鼠，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究飛速發(fā)展，到目前為止，已經(jīng)涌現(xiàn)出了許許多多的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物。在人們沉浸于轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物帶來的巨大成功時(shí)候，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的安全問題也更加凸顯。2012年9月21日，有一篇名為“吃了兩年轉(zhuǎn)基因谷物過半實(shí)驗(yàn)鼠長腫瘤”的報(bào)道給人們敲響了警鐘。我們不應(yīng)盲目

2、地進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)及應(yīng)用，必須做好對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物安全問題的檢測(cè)，避免轉(zhuǎn)基因研究過程中造成危害。安全檢測(cè)包括多個(gè)方面，首先，是基因水平的檢測(cè)，包括檢測(cè)外源基因在宿主基因組中的整合位點(diǎn)及其對(duì)宿主基因組表達(dá)的影響;其次，是轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)，檢測(cè)外源基因及宿主基因mRNA表達(dá)情況;第三，是翻譯水平的檢測(cè)，測(cè)量外源基因及宿主染色體基因的蛋白表達(dá)情況;第四，便是對(duì)模式動(dòng)植物實(shí)際應(yīng)用過程中的檢測(cè)，來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物是否真正安全。我們選擇本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)牛

3、MYF6基因鼠及內(nèi)蒙古大學(xué)轉(zhuǎn)秀麗線蟲FAT-1基因牛作為研究對(duì)象。
　　實(shí)驗(yàn)通過TAIL-PCR、hiTAIL-PCR及改進(jìn)的hiTAIL-PCR方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室三只轉(zhuǎn)基因鼠及轉(zhuǎn)基因牛進(jìn)行外源基因整合位點(diǎn)檢測(cè)，應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)整合位點(diǎn)附近基因mRNA表達(dá)情況進(jìn)行研究，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
　　1、在轉(zhuǎn)基因鼠A中得到一個(gè)特異性的條帶，將擴(kuò)增所得片段的測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知的鼠核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析之后發(fā)現(xiàn)外

4、源基因在宿主基因組的整合過程中發(fā)生了重組質(zhì)粒的首尾相連。
　　2、在轉(zhuǎn)基因鼠B中得到一個(gè)特異性序列，即重組質(zhì)粒整合到鼠12號(hào)染色體43264229之后且同源率為99％，其中有6bp的堿基為重組質(zhì)粒序列與小鼠基因組序列共有，證明外源基因在宿主基因組以同源重組的方式整合。
　　3、不論在轉(zhuǎn)基因鼠中還是轉(zhuǎn)基因牛中都有發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒不是在酶切位點(diǎn)斷開，而是在其它的任意堿基處隨機(jī)斷裂。
　　4、在轉(zhuǎn)基因鼠C發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒的3'端插入

5、小鼠2號(hào)染色體第171864372個(gè)堿基之前，重組質(zhì)粒與染色體之間不是直接連接，二者之間插入了未知序列;在14號(hào)染色體第13858398個(gè)堿基之前有重組質(zhì)粒插入，質(zhì)粒的斷裂位點(diǎn)在酶切位點(diǎn)之后第四位堿基處，隨機(jī)插入到14號(hào)染色體;在重組質(zhì)粒酶切位點(diǎn)下游設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增到轉(zhuǎn)基因牛中重組質(zhì)粒插入到16號(hào)染色體第13904955堿基位置之前的整合序列。這些結(jié)果證明外源基因的整合是多位點(diǎn)隨機(jī)整合，整合過程中可產(chǎn)生未知序列。
　　5、在整合

6、位點(diǎn)的檢測(cè)過程中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠A及轉(zhuǎn)基因牛中的一些結(jié)果中，宿主染色體的序列兩端各連接了一段未知序列，證明外源基因整合入宿主染色體，可導(dǎo)致宿主染色體序列的斷裂。
　　6、在進(jìn)行整合位點(diǎn)檢測(cè)時(shí)，經(jīng)常檢測(cè)到未知序列的情況，我們推測(cè)有可能是外源基因污染或者是由宿主在外源基因整合過程中基因斷裂的小堿基片段隨機(jī)組合形成。
　　7、通過熒光定量PCR研究IMMP2L基因mRNA水平表達(dá)，證明外源基因的整合會(huì)對(duì)整合位點(diǎn)附近的宿主基因表達(dá)造成