φC31整合酶介導(dǎo)的外源基因在?；蚪M中整合位點(diǎn)的分析與應(yīng)用.pdf

1、φC31整合酶是在φC31鏈霉菌(Streptomyces)噬菌體中發(fā)現(xiàn)的,可介導(dǎo)噬菌體在細(xì)菌基因組中發(fā)生位點(diǎn)特異性整合的重組酶。它同樣能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)攜帶有34bp attB序列的外源載體與基因組上的某些特定位點(diǎn)發(fā)生特異性整合,基因組上的該位點(diǎn)被稱為假attP位點(diǎn),其與噬菌體attP位點(diǎn)存在著一定的同源性。假attP位點(diǎn)廣泛存在于多種物種的基因組中,而且每個(gè)物種往往存在著多個(gè)假attP位點(diǎn)。為了探討應(yīng)用φ31整合酶在大動(dòng)物上進(jìn)行

2、遺傳操作和制備轉(zhuǎn)基因研究的可行性和有效性,在牛基因組尋找適合外源基因整合并使其高效表達(dá)的假attP位點(diǎn)是必須的。本研究在先前發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)牛假attP位點(diǎn)BpsF1、BpsM1的基礎(chǔ)上,繼續(xù)深入開(kāi)展對(duì)?；蚪M中能介導(dǎo)外源基因高效整合和表達(dá)的假attP位點(diǎn)的研究。
　　 本研究首先利用φC31整合酶介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因?qū)ε６つw成纖維細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,并篩選出兩個(gè)分別顯示綠色熒光蛋白較強(qiáng)和較弱的克隆,接著用反向PCR的方法對(duì)GFP基因

3、在基因組中的整合位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明,在這兩個(gè)細(xì)胞克隆中,外源載體均在attB序列的核心位置與?；蚪M發(fā)生整合,說(shuō)明其發(fā)生了位點(diǎn)特異性重組,染色體上的整合位點(diǎn)稱為牛基因組假attP位點(diǎn)。擴(kuò)增出的序列經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),在綠色熒光蛋白表達(dá)較強(qiáng)和較弱的兩個(gè)細(xì)胞克隆中,假attP位點(diǎn)分別位于牛的4號(hào)染色體(NW_001494928)以及10號(hào)染色體上(NW_001492885),我們將其命名為BF4、BF10位點(diǎn)。對(duì)這兩個(gè)假attP位點(diǎn)的

4、序列分析表明與先前發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)位點(diǎn)BpsF1、BpsM1一樣,BF4、BF10位點(diǎn)均不在編碼區(qū)。同時(shí)我們還運(yùn)用了熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對(duì)這兩個(gè)假attP位點(diǎn)在牛染色體上進(jìn)行定位,結(jié)果顯示BF4位點(diǎn)位于染色體的4q31區(qū),BF10位點(diǎn)位于染色體的10q35區(qū),與比對(duì)的結(jié)果相吻合。
　　 接著,我們對(duì)這四個(gè)牛假attO位點(diǎn)的整合頻率以及分別整合在BF4、BF10位點(diǎn)上的外源基因的表達(dá)情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示在共57個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞克隆

5、中有42個(gè)整合于BF4位點(diǎn)上,占74％(42/57),而整合于BF10、BpsF1位點(diǎn)的細(xì)胞克隆分別占7％(4/57)。另外,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)整合于BspM1位點(diǎn)的細(xì)胞克隆。該結(jié)果清楚地表明,φC31整合酶介導(dǎo)的外源基因在?；蚪M中的整合并不是隨機(jī)的,而且整合位點(diǎn)的選擇明顯地偏好于BF4位點(diǎn),即BF4位點(diǎn)為整合熱點(diǎn)。通過(guò)顯微鏡觀察、ELISA、FACS以及Western Blot的分析,都顯示在BF4位點(diǎn)上整合的GFP蛋白表達(dá)水平明顯高于BFl

6、0位點(diǎn)。ELISA檢測(cè)整合于BF4位點(diǎn)上的GFP水平為328μg/mg,是整合于BF10位點(diǎn)上的基因表達(dá)水平的2倍以上。該研究結(jié)果與在人、鼠基因組中存在的熱點(diǎn)位點(diǎn)特征相類似,即整合于熱點(diǎn)位點(diǎn)的外源基因均能得到高效地表達(dá)。這樣,我們?cè)谂；蛑邪l(fā)現(xiàn)了一個(gè)能被高頻地介導(dǎo)整合,而且能促進(jìn)外源基因高效表達(dá)的假attP位點(diǎn)。
　　 最后,為了進(jìn)一步提高外源基因分別整合在BF4或BF10位點(diǎn)上的頻率,我們作了進(jìn)一步探索,在表達(dá)綠色熒光蛋白的載

7、體上分別加入BF4或BF10位點(diǎn)的旁側(cè)序列,構(gòu)建成插入型同源重組載體,并在線性化位點(diǎn)上引入attB序列,試圖聯(lián)合利用φC31整合酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組以及同源重組機(jī)制促進(jìn)外源基因以更高的頻率整合于目的位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,這種經(jīng)過(guò)改造的定向載體能夠提高外源基因在目的位點(diǎn)的整合率,提高水平達(dá)20-50％,其中整合于BF4位點(diǎn)的細(xì)胞克隆占93％,而且整合于BF4位點(diǎn)的外源基因依然維持高效表達(dá)。
　　 本研究結(jié)果對(duì)應(yīng)用體細(xì)胞核移植(so