CRISPR-Cas9介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因在牛NANOG位點(diǎn)定點(diǎn)整合的研究.pdf

1、Nanog是一種在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)、原始生殖細(xì)胞以及ESCs表達(dá)的新轉(zhuǎn)錄因子。屬于ANTP類，NK家族基因。在胚胎發(fā)育及干細(xì)胞分化中有著重要作用。
　　本研究針對(duì)牛的NANOG基因的一段序列設(shè)計(jì)特異識(shí)別的gRNA并構(gòu)建了CRISPR/Cas9表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)選用的骨架載體具有新霉素抗性基因(Neor)表達(dá)框架和報(bào)告基因EGFP，構(gòu)建了針對(duì)CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)的同源打靶載體pNlrkt。其外源基因?yàn)镋GFP，在報(bào)告基因的上游包含長(zhǎng)8

2、01bp的5'同源臂，在(Neor)表達(dá)框架下游包含長(zhǎng)370bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析和序列測(cè)定分析的結(jié)果表明，所構(gòu)建的pNlrkt載體正確。
　　將構(gòu)建成功的載體pNlrkt用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入到人胚胎干細(xì)胞MelI細(xì)胞系中，經(jīng)24h培養(yǎng)后，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，結(jié)果表明pNlrkt載體可指導(dǎo)EGFP使其在人胚胎干細(xì)胞中發(fā)光。
　　為了獲得EGFP基因在NANOG基因位點(diǎn)定點(diǎn)整合的細(xì)胞系，檢測(cè)CRISPR/

3、Cas9介導(dǎo)的外源基因整合效率，通過電轉(zhuǎn)染的方法將CRISPR/Cas9: pNlrkt導(dǎo)入到秦川牛胎兒成纖維細(xì)胞中，經(jīng)過G418篩選、口吸管和流式細(xì)胞儀挑單克隆細(xì)胞、單克隆細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增獲得69株細(xì)胞系，最終經(jīng)3'和5'同源臂跨臂PCR檢測(cè)，最終獲得4株外源基因定點(diǎn)整合的細(xì)胞系。
　　本研究最終獲得4株NANDG定點(diǎn)整合細(xì)胞系，這些細(xì)胞系為后續(xù)進(jìn)一步研究NANOG在秦川牛早期胚胎發(fā)育中的作用以及提高胚胎發(fā)育率促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展提供了途