CRISPR-Cas9介導的丹參基因組編輯與丹參酮合成路徑的研究.pdf

1、中藥丹參來源于唇形科多年生的草本藥用植物丹參Salvia miltiorrhizaBunge的干燥根和根莖。廣泛分布于中國各地，種質(zhì)資源豐富。丹參藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有祛瘀止痛、通經(jīng)活血、清心除煩的功效，被用于治療心絞痛、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、瘀血腹痛等疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)其在保護心肌、擴張血管、抗動脈粥樣硬化、抗血栓、保肝及抗菌消炎方面有明顯療效。丹參中主要有效成分是脂溶性的丹參酮類和水溶性酚酸類化合物，包括丹參酮I、丹參

2、酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、丹參素、丹酚酸等。丹參酮類化合物是二萜醌結構，是類異戊二烯代謝途徑產(chǎn)生的，前體物質(zhì)是牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyldiphosphate,GGPP），但其下游合成通路的很多基因的功能尚不清楚。因此，如何挖掘這些基因的功能非常重要。
　　近年來，一種有效的基因敲除工具CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromi

3、c repeats）/Cas9（CRISPR associated protein9）的出現(xiàn)，為基因功能研究提供了很大助力。它可以利用一小段RNA作為引導，特異性識別靶向序列，再用核酸內(nèi)切酶Cas9對靶向序列進行酶切，破壞其DNA結構。針對不同的基因序列，只需要改變引導RNA的序列就可以成功實現(xiàn)基因編輯。相比于ZFNs和TALEN，CRISPR/Cas9構建簡單，打靶特異性高?？梢灶A見到CRISPR/Cas9介導的基因組編輯將在未來繼續(xù)

4、加快功能基因組學的研究步伐。本實驗利用CRISPR/Cas9方法敲除丹參酮合成途徑的關鍵基因，獲得了丹參酮缺陷型丹參游離毛狀根突變體，通過研究突變體的次生代謝變化，進而闡釋基因功能。
　　為了獲得丹參游離毛狀根突變體，在丹參基因組序列上設計了相應的CRISPR/Cas9敲除靶點。被靶向的基因如下：SmCPS1、SmCPS2、SmCPS4、SmP1D10、SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、SmCYP7

5、6AK3、Sm3383、Sm4361。利用變性銀染聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法檢測靶向序列DNA條帶，初步鑒定游離毛狀根突變體。通過直接測序和TA克隆后測序，鑒定了毛狀根突變體的基因型。已經(jīng)成功地獲得了SmCPS1和SmCYP76AH1的丹參毛狀根突變體株系，發(fā)現(xiàn)SmCPS1突變體的根表皮顏色與野生型相比發(fā)生了變化。為了提高CRISPR/Cas9的打靶效率，對所用CRISPR/Cas9載體做了丹參密碼子優(yōu)化的嘗試。
　　采用UPLC-

6、ESI-qTOF-MS檢測丹參游離毛狀根突變體的代謝產(chǎn)物變化，通過與野生型丹參毛狀根的代謝產(chǎn)物的EIC和TIC圖譜對比，發(fā)現(xiàn)在SmCPS1的純合毛狀根突變體內(nèi)完全檢測不到三種主要丹參酮類化合物（丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮）的含量，而嵌合突變體中這三種主要丹參酮類化合物的含量均有大幅度的下降，再次證明了SmCPS1是丹參酮合成通路中的關鍵基因。
　　本研究建立了CRISPR/Cas9-突變體-代謝分析-基因功能闡釋的方法體系，即