CRISPR-Cas9定點編輯豬基因組及克隆豬DNA異常甲基化研究.pdf

1、仔豬哺乳階段的生長狀況與后期的生長密切相關(guān)，而豬乳又是其賴以生存的營養(yǎng)來源。乳鐵蛋白在豬常乳中的含量較低，但其具有抗菌，抗病毒，促進(jìn)鐵吸收等多種功能。提高豬乳中乳鐵蛋白的含量對于仔豬的生長，抗逆性均有重要的作用。傳統(tǒng)的選育方式較難明顯的改善母乳品質(zhì)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)則提供了一個良好的應(yīng)用平臺。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)一般是通過將表達(dá)載體以隨機插入的方式導(dǎo)入受體細(xì)胞，其在表達(dá)量和安全性方面均不穩(wěn)定。CRISPR/Cas9技術(shù)自從用于編輯外源DNA以來，

2、目前已將其開發(fā)為具有多種功能的技術(shù)。利用CRISPR/Cas9對靶基因造成斷裂的同時發(fā)生同源重組的概率比自然發(fā)生同源重組的概率提高了一千倍以上，因此CRISPR/Cas9將為轉(zhuǎn)乳鐵蛋白基因豬的制備提供幫助。但CRISPR/Cas9技術(shù)目前面臨著效率較低，存在脫靶風(fēng)險等問題，因此我們對于如何提高CRISPR/Cas9對靶基因的剪切和脫靶問題進(jìn)行了初步的摸索。目前轉(zhuǎn)基因依賴的技術(shù)還有體細(xì)胞核移植，雖然該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用了接近20年，但人們對其涉

3、及的表觀重編程機制還不是很明了，所以目前體細(xì)胞克隆技術(shù)還存在著效率低下，以及出生后代有異常表型等癥狀。為此我們利用同一窩出生的具有異常表型的克隆豬和表型正常的克隆豬進(jìn)行了全基因組的甲基化測序，同時利用相同的樣品對轉(zhuǎn)錄組測序，希望能從表觀和基因表達(dá)方面找到影響克隆豬異常表型的原因。得到結(jié)果如下:
　　(1)設(shè)計出了針對CSN1S1基因有效的sgRNA，發(fā)現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)染方式對靶基因的剪切具有顯著的不同。其中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率相對較低，而核轉(zhuǎn)

4、方式可將剪切效率提高3-4倍。在沒有同源模板的情況下，斷裂的靶基因主要以缺失為主。
　　(2)成功設(shè)計了同源重組載體，將豬自身的乳鐵蛋白基因的CDS區(qū)通過2A連接在了CSN1S1基因同源臂之后。載體共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后經(jīng)過篩選得到了在CSN1S1基因后定點插入的轉(zhuǎn)乳鐵蛋白基因的成纖維細(xì)胞，為體細(xì)胞克隆提供素材。同時我們驗證了所使用的2A具有100％的自剪切功能，表達(dá)出來的重組乳鐵蛋白將不會影響α-S1酪蛋白的功能。
　　(3)

5、構(gòu)建了帶有熒光標(biāo)記的Cas9表達(dá)載體，利用流式細(xì)胞術(shù)篩選，大大提高了富集細(xì)胞的剪切效率，基本上達(dá)到了基因的完全敲除，為基因功能的研究提供了工具。我們利用該載體通過G418的篩選獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)Cas9基因的PK15細(xì)胞株，為以后構(gòu)建sgRNA文庫提供了方便。同時針對一個基因設(shè)計多個sgRNA共同轉(zhuǎn)染，通過對靶基因的Western blot檢測發(fā)現(xiàn)蛋白表達(dá)相對單個sgRNA的效率顯著降低。
　　(4)針對截短型的sgRNA脫靶情況進(jìn)行了分

6、析，發(fā)現(xiàn)隨著sgRNA的截短(17-19bp)，脫靶的風(fēng)險會顯著增加，同時意味著可選擇的sgRNA的數(shù)量變少。針對選擇的截短型sgRNA脫靶驗證發(fā)現(xiàn)，在某些位點截短型的sgRNA確實降低了脫靶，但有些位點的脫靶卻并沒有降低。盲目選擇截短的sgRNA會有靶向效率降低，脫靶效率增加的風(fēng)險。
　　(5)針對克隆豬的DNA甲基化測序發(fā)現(xiàn)，異?？寺∝i在全基因組范圍內(nèi)去甲基化位點要多余高甲基化位點，但在CpG島內(nèi)，異?？寺∝i的甲基化水平卻高于

7、正常克隆豬。通過對差異甲基化位點的注釋，發(fā)現(xiàn)同一個基因內(nèi)可以同時有低甲基化和高甲基化的現(xiàn)象。七種重復(fù)序列的甲基化水平發(fā)生變化。對轉(zhuǎn)錄組測序共發(fā)現(xiàn)了1700多個差異表達(dá)基因，其中1500多個基因是上調(diào)表達(dá)。243個基因的甲基化水平和表達(dá)水平均發(fā)生了變化。MAPK信號通路是差異表達(dá)基因主要富集的通路之一。
　　(6)通過對甲基化數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化和基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄起始位點附近呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。正?？寺∝i基因區(qū)的甲