利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建定點(diǎn)突變小鼠品系.pdf

1、基因敲除動(dòng)物模型是在活體動(dòng)物上開展基因功能研究、尋找合適藥物作用靶標(biāo)的重要工具。對(duì)于了解人類生殖、胚胎發(fā)生和發(fā)育、遺傳疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物的篩選發(fā)揮重要作用。小鼠不但在生理上與人類相似，而且現(xiàn)已經(jīng)積累了非常多的遺傳資源，是研究人類疾病理想的動(dòng)物模型。由于傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)的復(fù)雜性，且存在費(fèi)時(shí)，困難，工作量大，效率低的問題，難以滿足日益增長的科研需求。
　　隨著最近對(duì)細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗噬菌體感染等外來遺傳物質(zhì)侵襲機(jī)制的揭示，基于改造自細(xì)

2、菌獲得性免疫機(jī)制的CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種富有潛力的基因編輯工具獲得了科研人員的青睞。
　　目的:
　　為得到特定位點(diǎn)突變的小鼠疾病模型。
　　方法:
　　文章針對(duì)Kdm2b蛋白酶活關(guān)鍵位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的DNA序列設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)并與Cas9 mRNA共注射小鼠受精卵。將針對(duì)Fmo3基因的sgRNA、Cas9mRNA及對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變單鏈寡核苷酸(ssODN)修復(fù)模板共注射到小鼠受精卵雄原核。得到F0代小鼠，并采用

3、T7 EndonucleaseⅠ酶切實(shí)驗(yàn)及基因測(cè)序檢測(cè)其堿基的突變。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)基因修飾的小鼠中同時(shí)得到了Kdm2b基因發(fā)生移碼突變的基因失活型以及關(guān)鍵酶活位點(diǎn)缺失的酶活突變型首建小鼠。同樣成功得到了Fmo3基因發(fā)生移碼突變的基因敲除和單堿基定點(diǎn)突變的首建小鼠，且基因都發(fā)生了高效的生殖系轉(zhuǎn)移，成功建系。
　　結(jié)論:
　　通過本研究表明采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用同源重組修復(fù)依賴與非依賴的兩種方式可快