水稻抽穗基因Hdl的CRISPR-Cas9載體構(gòu)建及結(jié)果分析.pdf

1、水稻（Oryza sativa L.）是重要的糧食作物之一，其抽穗期是影響水稻種植和生產(chǎn)的重要因素之一，它決定著水稻品種種植的生態(tài)區(qū)域和季節(jié)適應(yīng)性。水稻抽穗期是由多種基因控制的數(shù)量性狀，受到水稻本身的遺傳因素以及環(huán)境因子的共同影響。Hd1是水稻抽穗期基因之一，是擬南芥CO的同源基因。與擬南芥中CO基因促進開花的作用不同，水稻中的Hd1基因具有雙重作用:在短日照條件下促進抽穗，長日照條件下延遲抽穗。CRISPR/Cas系統(tǒng)是近年來新的基因

2、組編輯技術(shù)，是利用RNA引導Cas9蛋白核酸酶在特定的基因組位點上進行切割和修飾。與ZFN、TALEN這兩種基因組編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas系統(tǒng)的操作性更高，突變效率更高，而且容易在第一代得到純合的突變體，理論上可在不同的基因位點同時引入多個突變。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是組分較簡單的、目前研究的最深入的TypeⅡ型CRISPR/Cas系統(tǒng)。本實驗通過構(gòu)建Hd1的CRISPR/Cas9敲除載體，導入特早熟粳稻品種Kitaake

3、、秈稻品種珍汕97以獲得hd1突變體。CRISPR/Cas9的效果是由測序檢測轉(zhuǎn)基因植株Hd1基因是否突變，突變方式以及田間突變體植株抽穗期的早晚鑒定。
　　本實驗利用改造好的CRISPR/Cas9載體敲除水稻的Hd1基因。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的pCAMBIA1300∷Hd1sgRNA∷Cas9表達載體轉(zhuǎn)入水稻受體材料Kitaake、珍汕97中，獲得新的hd1突變體植株。具體研究結(jié)果如下:
　　1.為了保證C

4、RISPR/Cas9敲除Hd1靶位點的特異性，根據(jù)Gramene網(wǎng)站上公布的粳稻、秈稻的Hd1基因的序列與Kitaake、珍汕97中Hd1測序序列比對分析，我們在Hd1基因的第一個外顯子上設(shè)計了一個CRISPR/Cas9靶位點:一個含有ApaLI酶切位點、符合CRISPR/Cas9系統(tǒng)的sgRNA引物。
　　2.將設(shè)計好的Hd1sgRNA引物退火形成雙鏈后連入CRISPR/Cas9載體。再將Hd1sgRNA∷Cas9連入表達載體p

5、CAMBLA1300。利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的pCAMBIA1300∷Hd1sgRNA∷Cas9表達載體轉(zhuǎn)入水稻受體材料Kitaake、珍汕97的愈傷組織中，經(jīng)潮霉素的抗性篩選與分化，最終獲得Kitaake背景的127株再生轉(zhuǎn)基因植株。
　　3.利用PCR技術(shù)擴增潮霉素基因片段。對再生轉(zhuǎn)基因植株進行潮霉素陽性鑒定，獲得了24株含有潮霉素陽性轉(zhuǎn)基因植株。
　　4.確定發(fā)生突變的轉(zhuǎn)基因植株。在潮霉素陽性轉(zhuǎn)基因植株中

6、，使用PCR擴增含有CRISPR/Cas9靶位點的Hd1片段;然后利用ApaLI酶切擴增產(chǎn)物，標記產(chǎn)物未能被酶切的單株（即突變單株）;然后將這些標記單株的擴增產(chǎn)物連入pEasy-Blunt載體進行單克隆測序。在24株T0代潮霉素陽性植株中找到3株hd1突變單株。
　　5.3株hd1突變體植株的突變方式表明:這些植株在Hd1基因的CRISPR靶位點有堿基的插入、缺失，替換。一株(Plant1-4)是雜合型，其突變方式是有一個堿基的替