利用TALENs和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)改良水稻稻瘟病抗性.pdf

1、水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，供養(yǎng)了世界將近50％的人口。由子囊菌Magnaporthe oryzae（無性世代:Pyricularia oryzae）引起的稻瘟病，是水稻生產(chǎn)上最嚴(yán)重的病害之一，常常導(dǎo)致水稻產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失。實(shí)踐證明增強(qiáng)水稻的稻瘟病抗性是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。在常規(guī)的稻瘟病抗性育種中，需要通過不斷雜交和回交才能將多個(gè)抗病基因聚合到一個(gè)水稻材料中，時(shí)間往往需要十年甚至更長(zhǎng)。但是，

2、高度變異的稻瘟病菌致病性經(jīng)常導(dǎo)致抗性品種的抗性快速消失。
　　通過RNAi(RNA interference)技術(shù)下調(diào)稻瘟病感病基因或感病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)是提高水稻稻瘟病抗性的一種有效途徑。但不同的RNAi轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量往往不一致，難以獲得穩(wěn)定的高表達(dá)轉(zhuǎn)入株系;且因?yàn)檗D(zhuǎn)基因安全問題，RNAi轉(zhuǎn)基因植株還面臨嚴(yán)格的管理流程。然而，TALENs(Transcription activator-like effector nu

3、cleases，TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated9)技術(shù)卻沒有RNAi的這些缺陷，其不僅能精確和高效地靶向敲除特定基因;且在獲得基因得以修飾的突變體后，能通過自交或雜交剔除外源基因以消除轉(zhuǎn)基因安全顧慮。
　　水稻OsERF922基因編碼一個(gè)AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子，能受致病性和

4、非致病性稻瘟病菌的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。OsERF922蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)，能特異地與GCC盒序列結(jié)合，起轉(zhuǎn)錄激活作用。OsERF922負(fù)調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性。
　　本研究分兩部分內(nèi)容，一部分研究基于AvrXa23的TALENs能否靶向修飾OsERF922基因;另一部分利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向修飾OsERF922基因以改良水稻的稻瘟病抗性，同時(shí)對(duì)CRISPR/Cas9的打靶特征進(jìn)行了較詳細(xì)的分析。主要結(jié)果如下:
　　1、針

5、對(duì)OsERF922設(shè)計(jì)了3對(duì)基于AwXa23的TALENs(T-KJ5/KJ6、T-KJ7/KJ8和T-KJ9/KJ10)。其中，T-KJ5/KJ6和T-KJ7/KJ8在水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)試驗(yàn)中未檢測(cè)到切割活性;T-KJ9/KJ10在水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)試驗(yàn)、愈傷組織和T0植株中都檢測(cè)到切割活性，且在愈傷組織和T0植株中靶向誘導(dǎo)OsERF922突變的頻率分別為15.0％和2.73％，說明基于AvrXa23的TALENs系統(tǒng)能用于水稻基因組定點(diǎn)

6、編輯。此外，在用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)含靶點(diǎn)的PCR片段時(shí)，除了單堿基替換的突變類型外，其它所有突變類型的PCR片段與野生型片段相比都能顯示出大小差異;說明PCR/PAGE法也可以用于靶點(diǎn)突變檢測(cè)，尤其是靶點(diǎn)切割區(qū)無限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)時(shí)。
　　2、在單靶標(biāo)、雙靶標(biāo)和三靶標(biāo)Cas9/sgRNA載體pC-ERF922S2、pC-ERF922S1S2和pC-ERF922S1S2S3轉(zhuǎn)化空育131的T0植株中，C-ERF

7、922S2、C-ERF922S1S2和C-ERF922S1S2S3誘導(dǎo)OsERF922突變的頻率分別為42.0％、70.0％和90.0％，誘導(dǎo)產(chǎn)生純合突變子的頻率分別為14.3％、47.6％和40.7％，說明誘導(dǎo)的突變頻率隨著Cas9/sgRNA靶標(biāo)數(shù)的增加而增大，且雙靶標(biāo)Cas9/sgRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生純合突變子的頻率最高。此外，在pC-ERF922S1S2S3轉(zhuǎn)化空育131和吉粳88的T0植株中，C-ERF922S1S2S3誘導(dǎo)OsER

8、F922突變的頻率分別為90.0％和92.5％，說明在不同水稻材料中相同Cas9/sgRNA靶向誘導(dǎo)的突變頻率基本一致，無顯著差異。
　　3、在統(tǒng)計(jì)的325次Cas9/sgRNA誘導(dǎo)的突變事件中（不包括任意兩個(gè)靶點(diǎn)之間有整段缺失或同時(shí)有整段缺失和插入的突變事件），大部分突變類型為堿基缺失(55.1％，179/325)，其次為堿基插入(39.4％，128/325)，再次為同時(shí)有堿基插入和缺失(4.3％，14/325)，最少的為單堿基

9、替換(1.2％，4/325)。此外，突變所涉及的堿基數(shù)從1bp到200bp不等，且大部分突變只涉及到單個(gè)堿基(52.3％，170/325)。在堿基缺失的突變中，大部分(69.8％，125/179)為少數(shù)幾個(gè)堿基的缺失(＜10bp)，其它30.2％(54/325)為多數(shù)堿基的缺失(10-152 bp);在堿基插入的突變中，幾乎都為單堿基插入(96.1％，123/128)，且插入A(42.2％,54/128)或T(46.1％，59/128)

10、的頻率遠(yuǎn)高于插入G(1.5％，2/128)或C(6.2％，8/128)的頻率。
　　4、在分析Cas9/sgRNA誘導(dǎo)的突變向從T0向T1和T2代的遺傳中，12個(gè)T0植株和5個(gè)T1植株中的突變都能穩(wěn)定地遺傳給下一代，且在向下一代的遺傳過程中符合孟德爾遺傳定律。此外，在PCR檢測(cè)T-DNA-free植株時(shí)，230個(gè)T1植株（12個(gè)T0植株的后代）中有18株未擴(kuò)增出目的條帶，147個(gè)T2植株（5個(gè)T1植株的后代）中有46株未擴(kuò)增出目的