利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除HeLa細胞的DHRS4基因.pdf

1、輔酶Ⅱ依賴性視黃醛脫氫還原酶（NRDR）是從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種酶，能有效地氧化視黃醇與還原視黃醛。視黃醇在體內(nèi)經(jīng)兩步代謝生成維甲酸，其中間代謝產(chǎn)物為視黃醛。視黃醛的合成反應是體內(nèi)維甲酸合成的限速步驟，因此N RDR在維持生物體內(nèi)維甲酸的平衡過程中起著重要作用。NRDR也在人以及其他哺乳動物中普遍表達，由DHRS4基因編碼。其除參與維甲酸代謝外，對類固醇激素、α-雙羰基化合物等也具有催化活性。
　　全反式維甲酸是維生素A的代謝產(chǎn)

2、物，是脊椎動物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，通過與其核內(nèi)受體結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄參與細胞生長、分化、形態(tài)發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)等生理過程。臨床上，維甲酸類化合物已廣泛應用于預防及治療一些惡性腫瘤，包括乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌和早幼粒細胞白血病等。體內(nèi)維甲酸類化合物的平衡受飲食及其相關(guān)代謝酶等因素的影響，但其在體內(nèi)具體的調(diào)控機制仍有待研究。
　　成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復（CRISPR，Clustered regularly interspaced

3、 short palindromic repeats）是一種來自細菌降解外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統(tǒng)需要CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，Cas9蛋白含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。crRNA（CRISPR-derived RNA）與tracrRNA（trans-activating crRNA）通過堿基配對結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復合物，該復合物能夠引導核酸酶Ca

4、s9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。通過人為設(shè)計這兩種特殊的RNA，我們可以合成具有引導作用的sgRNA（singleguide RNA），從而引導Cas9蛋白對DNA進行定點切割。
　　我們實驗室在DHRS4基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其表達產(chǎn)物NRDR蛋白功能方面進行了大量細致的研究工作，取得了一定的成果。目前亟需建立DHRS4或NRDR敲除的細胞和動物模型。本課題利用CRISPR/Cas9技術(shù)，建立了敲除DHRS4