利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)建立豬MSTN自然突變體細(xì)胞系.pdf

1、肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin，MSTN)，又稱為GDF-8(growth differentiationfactor8)，具有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族的共有的結(jié)構(gòu)特征。它對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育起到負(fù)調(diào)控作用。第一次在小鼠中發(fā)現(xiàn)MSTN基因后，McPherron等(1997)對(duì)其進(jìn)行敲除研究，發(fā)現(xiàn)MSTN敲除的小鼠表現(xiàn)出明顯的雙肌性狀。由于肌肉增生和肥大使得小鼠肌肉明顯的增加。后來(lái)相繼在牛、狗和羊及人中發(fā)現(xiàn)了MSTN的天然突變，這些天然突變能夠

2、引起明顯的雙肌性狀。CRISPR/Cas9是最近發(fā)展起來(lái)的簡(jiǎn)單、高效的基因編輯技術(shù)，可以識(shí)別DNA，在特定位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行切割，形成雙鏈切口(double strand break，DSB)，其有兩種修復(fù)方式，一種是可以引入插入缺失突變的非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)修復(fù)機(jī)制，另一種是同源重組(Homologous recombination，HR)，可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)堿基或者長(zhǎng)片段的定點(diǎn)突變

3、。目前已有很多團(tuán)隊(duì)對(duì)MSTN進(jìn)行了研究，他們分別通過(guò)ZFN技術(shù)，TALEN技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)動(dòng)物MSTN基因在不同位置進(jìn)行了隨機(jī)敲除，但是這些動(dòng)物產(chǎn)生的雙肌表型不如MSTN基因自然突變明顯，在動(dòng)物的前肢、后肢、胸部等部位并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的肌肉增加。為了建立肌肉表型更加明顯的MSTN突變豬，本實(shí)驗(yàn)擬利用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合ssODN(single strand oligo DNA)，模擬在動(dòng)物上發(fā)現(xiàn)的MSTN自然

4、突變，建立MSTN基因修飾豬。
　　我們選擇了分別在皮埃蒙特牛和狗物種中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的二個(gè)MSTN自然突變類型。其中，皮埃蒙特牛是在第313位氨基酸發(fā)生了變化，由于堿基G突變?yōu)锳使得半胱氨酸變?yōu)榱死野彼?，這種變化破壞了TGF-β超家族典型的半胱氨酸結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)失活;狗是939-940位缺失了兩個(gè)堿基TG，導(dǎo)致第313位半胱氨酸變?yōu)榱私K止密碼子。
　　我們首先構(gòu)建了分別針對(duì)皮埃蒙特牛和狗MSIN基因的自然突變位點(diǎn)的gRNA和2

5、條含有酶切位點(diǎn)的相應(yīng)單鏈寡核苷酸。然后將gRNA、Cas9和ssODN電轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞，加G418藥物篩選陽(yáng)性克隆，分盤(pán)培養(yǎng)，對(duì)挑取的單克隆進(jìn)行PCR，酶切鑒定及DNA測(cè)序，其中狗的自然突變位點(diǎn)(937/938)挑了134個(gè)克隆，鑒定55個(gè)，得到5株純的定點(diǎn)突變的陽(yáng)性克隆(5/55，9％)，皮埃蒙特牛自然突變位點(diǎn)(936 G-A)挑了70個(gè)克隆。鑒定37個(gè)克隆，得到1株純合定點(diǎn)突變，2株雜合子(3/37，8.1％)。我們以篩選出的陽(yáng)性

6、細(xì)胞克隆作為供體細(xì)胞，進(jìn)行核移植，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的重構(gòu)胚胎囊胚率達(dá)到27.3％，達(dá)到了核移植的正常水平。我們共獲得了490枚胚胎，移植到5頭代孕母體的輸卵管中，一頭成功懷孕并分娩1頭仔豬，我們剪取仔豬的耳朵組織提取基因組，進(jìn)行基因型鑒定。PCR和DNA測(cè)序結(jié)果顯示這頭仔豬是含有皮埃蒙特牛自然突變位點(diǎn)的936G-A純合突變。
　　總結(jié)，我們首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)和ssODN成功模擬MSTN基因自然突變，為獲得肌肉表型更明顯