CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)綿羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞MSTN基因的靶向敲除研究.pdf

1、CRISPR/Cas9技術(shù)是一種新型的基因組靶向修飾技術(shù)，可以對(duì)生物體基因組特異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)改造。能夠高效的在靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈缺口(Double-strand breaks，DSB)。通過(guò)有錯(cuò)誤傾向的非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)機(jī)制修復(fù)，從而引入插入缺失突變。肌肉生長(zhǎng)抑制素（Myostatin，MSTN）是一類能夠在骨骼肌中特異表達(dá)，并對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)起到負(fù)調(diào)控作用的糖蛋白，又被稱為

2、生長(zhǎng)分化因子-8(Growth differentiation factor-8，GDF-8)，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族。MSTN基因的缺失或突變可引起動(dòng)物出現(xiàn)“雙肌”性狀，促進(jìn)動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)肉性能。利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備MSTN基因敲除的綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞，為制備MSTN基因敲除綿羊個(gè)體提供了材料。
　　試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4組特異靶向綿羊MSTN基

3、因的靶位點(diǎn)，通過(guò)酶切連接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架載體中并對(duì)其測(cè)序驗(yàn)證。通過(guò)酶消化法，分離培養(yǎng)了綿羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的角度對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)一代測(cè)序和SURVEYOR分析對(duì)載體的有效性和敲除效率進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)用極限稀釋的方法挑選基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞克隆，再通過(guò)TA克隆的方法確定基因突變類型，并對(duì)突變后的基因序列進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析。
　　成功構(gòu)建

4、了4個(gè)能夠靶向MSTN基因的特定位點(diǎn)的CRISPR/Cas9打靶載體。細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有融合形成肌管的能力;RT-PCR結(jié)果表明肌衛(wèi)星細(xì)胞的特異表達(dá)基因MyoG、MyoD、Myf5等在細(xì)胞中均有表達(dá)，說(shuō)明分離的細(xì)胞確為肌衛(wèi)星細(xì)胞。按照最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，測(cè)序結(jié)果顯示pX330-target1和pX330-target4載體作用的靶位點(diǎn)處出現(xiàn)突變，SURVEYOR分析檢測(cè)其在靶位點(diǎn)產(chǎn)生突變的效率分別為24.20％和

5、10.18％。通過(guò)極限稀釋法，共獲得12個(gè)MSTN基因突變的細(xì)胞克隆，其中一株為純合突變。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)突變基因靶位點(diǎn)處一般有小片段堿基插入或缺失突變，部分會(huì)出現(xiàn)移碼突變。生物信息學(xué)分析表明:突變后的MSTN基因已經(jīng)失去了原有的生物活性，該基因已被成功敲除。成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)綿羊MSTN基因的特異敲除，證明該系統(tǒng)可有效應(yīng)用于綿羊的基因組編輯，獲得的具有穩(wěn)定突變的細(xì)胞克隆和構(gòu)建的CRISPR打靶載體為后續(xù)制備MSTN