利用CRISPR-CAS9技術(shù)創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜多室突變體.pdf

1、利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行定向基因編輯，創(chuàng)造新型種質(zhì)資源已經(jīng)在多種重要作物中得到成功的運(yùn)用。在甘藍(lán)型油菜中，多室性狀能夠增加每角果粒數(shù)從而達(dá)到增產(chǎn)目的，但是在自然條件下還沒有發(fā)現(xiàn)多室突變體。根據(jù)模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的多室角果形成的相關(guān)途徑和基因。我們挑選了甘藍(lán)型油菜中的BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2作為甘藍(lán)型油菜的多室候選靶基因，設(shè)計(jì)它們的CRISPR/Cas9編輯載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

2、創(chuàng)建這些候選基因的突變體。在此基礎(chǔ)上，一方面可以確定這些基因功能，另一方面也可以創(chuàng)建多室突變體，為油菜的高產(chǎn)育種提供新的種質(zhì)資源。主要結(jié)果如下:
　　1.生物信息學(xué)分析表明，甘藍(lán)型油菜中BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2基因的結(jié)構(gòu)和擬南芥的同源基因基本相同。根據(jù)這些基因的結(jié)構(gòu)，我們針對(duì)各個(gè)候選基因設(shè)計(jì)了2-4個(gè)靶位點(diǎn)，構(gòu)建了它們的多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法分別獲得

3、了119、40、319和108株BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3和BnaRPK2的T0代轉(zhuǎn)基因單株。陽性鑒定結(jié)果表明BnaCL V1、BnaCLV2、BnaC V3和BnaRPK2轉(zhuǎn)基因單株的陽性率分別為84.9％、92.5％、85.3％和83.8％。對(duì)陽性單株進(jìn)行非變性PAGE膠的編輯檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)47、22、35和38株材料發(fā)生了突變，突變的效率為12.9％-59.5％。
　　2.進(jìn)一步對(duì)BnaCLV1、BnaCLV

4、3和BnaRPK2的T0代編輯單株的靶點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)序驗(yàn)證。，發(fā)現(xiàn)這些編輯單株都在PAM結(jié)構(gòu)上游3-4bp處發(fā)生了不同形式的堿基缺失和插入，其中單堿基插入的頻率最高。對(duì)部分T1代株系的分析發(fā)現(xiàn)，這些突變可以穩(wěn)定地遺傳到下一代。
　　3.在BnaCL V1、BnaCLV2、BnaCLV3的T0代突變體中，觀察到2.9％-10.8％的單株具有多室角果的突變表型，可能為純合突變體。證明了BnaCLV1、BnaCLV2、BnaCLV3就是控制