激活標(biāo)簽法初步構(gòu)建甘藍型油菜突變體庫.pdf

1、突變體是進行基因功能鑒定的重要材料，而構(gòu)建起大規(guī)模的突變體庫則是進行功能基因組學(xué)研究的重要內(nèi)容。構(gòu)建突變體庫的方法多種多樣，有誘變法、同源重組、基因沉默、插入突變等。因插入突變法容易獲得旁側(cè)序列，從而快速克隆突變基因，因而較其他方法更具優(yōu)越性。目前，作為植物學(xué)研究的模式植物，擬南芥的插入突變體庫近乎飽和，水稻的插入突變體庫也達到一定規(guī)模，但同樣擁有重要研究價值的油菜，有關(guān)插入突變體庫的研究卻較少。
　　 我們利用激活標(biāo)簽載體pX

2、T246轉(zhuǎn)化甘藍型油菜寧油12號，對T1和T2的表型進行了統(tǒng)計，對T2部分植株基因組T-DNA插入片段的側(cè)翼序列進行了擴增，對激活標(biāo)簽載體pXT246進行了改造并轉(zhuǎn)化了擬南芥研究了其表達情況，主要的研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　 1.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法將激活標(biāo)簽載體pXT246轉(zhuǎn)化到甘藍型油菜寧油12號，通過濃度為0.2‰的Basta初篩與PCR分子鑒定獲得了40株轉(zhuǎn)基因植株。觀察發(fā)現(xiàn)，T1在葉片顏色、葉片形態(tài)、花瓣顏色、花瓣形

3、態(tài)、雌蕊、角果顏色、角果形態(tài)、植株分枝數(shù)目等方面出現(xiàn)了顯性性狀的表型。
　　 2.T2株系中有子葉、花、角果以及株型等性狀變化明顯，如葉片數(shù)目減少;葉片顏色變深綠;葉片表面光澤度高;葉片葉形為心型;雄蕊數(shù)目改變;有效分支數(shù)增加或減少;有高大植株也有矮小植株等。另外也發(fā)現(xiàn)，高大植株中有部分開花期也提前，矮小植株中有部分開花期延后，同時葉片顏色也較深綠。但在以上表型中，符合孟德爾分離規(guī)律的株系只有有效分支數(shù)減少的AN27株系和苗期葉

4、片表面積變大的AN39株系。對于AN27和AN39轉(zhuǎn)基因株系，用限制性酶切位點步移PCR、Tail-PCR、PCR-Walking方法擴增突變體T-DNA插入片段側(cè)翼序，目前還未得到側(cè)翼序列，擴增方法的優(yōu)化仍待進一步研究。
　　 3.為了更加有效地篩選轉(zhuǎn)基因植株，我們在激活標(biāo)簽載體中加入根特異啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋白，以期在剛剛萌發(fā)時，下胚軸露出時，檢測到紅色熒光蛋白，從而分離出轉(zhuǎn)基因的種子。將激活標(biāo)簽載體pXT246的GFP基