擬南芥激活標簽突變體篩選.pdf

1、目前，我國乃至世界上有很多地區(qū)的土壤鹽堿化程度較高，并且呈上升趨勢。在這些地區(qū)，土壤中的高鹽作為非生物脅迫因子嚴重影響著植物的生長，同時極大地限制了該區(qū)域農(nóng)作物的產(chǎn)量和分布，因此，提高植物特別是農(nóng)作物的抗逆能力尤為重要。先前的研究表明，植物的脅迫反應是一個相當復雜的過程，且不同植物對于脅迫的反應存在一定差異。鑒于模式植物擬南芥具有基因組小、生長周期短、自花閉花授粉、易于遺傳轉化、便于栽培等特點，同時，它又是甜土植物，雖然不抗鹽，但是相關

2、研究表明它的基因組中含有很多與耐鹽相關的基因，特別適于遺傳學研究。因此，本實驗以擬南芥激活標簽突變體庫為材料，對耐鹽及耐低鉀突變體進行了篩選，以期獲得擬南芥耐逆機制的更多信息。
　　本實驗首先運用分別含有70 mM NaCl、200 mM NaCl、50μM K+/50 mM NaCl、50μM K+/150 mM NaCl的四種MS培養(yǎng)基對三個擬南芥激活標簽突變體庫進行了表型篩選，隨后以篩選出的短根突變體 sr為材料，進行了突變

3、基因的克隆，結果如下:
　　1.篩選得到一株低鹽敏感突變體lss。當把株系1684與Col0轉移至70mM NaCl MS培養(yǎng)基上時，1684的部分植株(lss)出現(xiàn)了根生長停止、子葉卷曲萎黃等低鹽敏感現(xiàn)象，敏感植株與普通植株的比例約為1:1，而Col0全部生長正常。隨后，將鹽敏感植株的T2代幼苗轉移至70 mM NaCl的MS培養(yǎng)基上時，部分植株(T2代lss)也出現(xiàn)了根生長停止、子葉卷曲萎黃等低鹽敏感現(xiàn)象，敏感植株與普通植株的

4、比例也接近1:1，兩代的分離比都不符合孟德爾定律，仍需要進一步回交驗證。
　　2.篩選得到短根突變體sr與mr。篩選中意外發(fā)現(xiàn)株系1082的T1代植株在基本培養(yǎng)基上生長10天左右時，根長出現(xiàn)了三種表型的分離:第一種(sr)根明顯短于Ws；第二種(mr)短于Ws，但是長于sr，介于兩者之間；第三種與Ws相似，三種表型的數(shù)量比接近1:1:1.將 sr、mr、Ws一同移入土壤培養(yǎng)50天左右時，通過統(tǒng)計分析其他表型如株高、根長、葉片數(shù)、葉

5、片大小、果莢數(shù)等發(fā)現(xiàn)，sr植株最矮小、根長最短、葉片和果莢數(shù)最少，Ws植株最高大、根長最長、葉片果莢數(shù)最多，突變體mr除基部葉片數(shù)多于Ws外，其余統(tǒng)計值仍處于兩者之間。隨后，將短根的sr移入土壤單株收取了T2代種子，以相同方式播種于MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天左右，發(fā)現(xiàn)sr的T2代植株全部表現(xiàn)短根，表型沒有發(fā)生分離。
　　3.以篩選得到的短根突變體sr為材料，進行了突變基因的克隆。實驗中首先對短根突變體 T-DNA的綠色熒光蛋白基因 GF

6、P進行了PCR擴增，得到約300-400bp目的條帶，從而驗證了兩株突變體的T-DNA都沒有丟失；通過TAIL-PCR方法對短根突變體T-DNA插入位點附近的側翼序列進行了分離，經(jīng)過三輪擴增反應后，兩株突變體都出現(xiàn)了目的條帶，長度約為1500bp；通過GeneClean法回收純化擴增片段后，連接入含有氨芐抗性的pMD18-T載體中，對大腸桿菌進行了轉化；通過氨芐霉素篩選后，提取質粒并進行了酶切驗證，在約1500bp處出現(xiàn)了目的條帶；送測