擬南芥黃萎病菌敏感型突變體的篩選與分析.pdf

1、棉花黃萎病是由黃萎病菌引起的一種土傳病害，世界各大棉區(qū)均有分布，我國的棉花黃萎病主要由大麗輪枝菌引起的。大麗輪枝菌寄主廣泛，且容易發(fā)生變異，致病力分化較明顯，致病機(jī)理復(fù)雜，目前缺乏有效的防治藥物，再加上抗源材料的匱乏，使得棉花黃萎病的防治變得愈加艱難。運(yùn)用現(xiàn)代分子生物技術(shù)培育抗病棉品種將成為解決這一難題的一個可行途徑。當(dāng)用大麗輪枝菌侵染擬南芥幼苗時，幼苗植株會出現(xiàn)子葉萎黃，花青素積累，植株發(fā)育矮小等典型的黃萎病癥狀。棉花的基因組龐大，生

2、長周期長等特點(diǎn)，使得發(fā)掘棉花抗性基因的進(jìn)展緩慢。而模式植物擬南芥因?yàn)榛蚪M小等優(yōu)點(diǎn)在研究棉花抗黃萎病的機(jī)制上具有很大的發(fā)展前景。
　　本研究將T-DNA庫的種子點(diǎn)于含瓊脂濃度為0.6％的MS培養(yǎng)基上，春化3 d，培養(yǎng)12 d后，將生長良好的幼苗移入土中，成熟后單株收種子并編號。因?yàn)檎n題組篩選的是敏感型突變體，而表型好的敏感型突變體多會因?yàn)榘l(fā)病嚴(yán)重而死亡。這個方法的優(yōu)點(diǎn)就在于即使表型好的突變體死亡，也可以根據(jù)事先的種子編號進(jìn)行下步實(shí)

3、驗(yàn)。將收到的種子按編號點(diǎn)在含瓊脂濃度為0.6%的MS培養(yǎng)基上，材料室生長8d后，將擬南芥幼苗擺在含瓊脂濃度為1%的MS培養(yǎng)基上，在幼苗的根尖處滴1μL濃度為5×105個孢子/mL的黃萎病菌孢子懸浮液，菌處理8-10 d，擬南芥幼苗開始出現(xiàn)黃萎病的癥狀，這些是對黃萎病菌敏感的突變體，將其移入土中觀察其在土中的生長情況。本實(shí)驗(yàn)從突變體庫中篩選到3株能穩(wěn)定遺傳的突變體：sr1、s63和s133，這為研究棉花的抗黃萎病機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)材料。正常培

4、養(yǎng)基上生長8d的突變體sr1在培養(yǎng)基上接種8-12d后發(fā)病較野生型WT嚴(yán)重，植株葉片先是褪綠，接著萎黃后枯黃，接種20d后，子葉干枯程度較WT嚴(yán)重，植株生長發(fā)育矮小。將接種9 d的幼苗移植到土壤生長22d后發(fā)現(xiàn)，和野生型WT相比其在土壤中生長受限，植株發(fā)育矮小，說明突變體sr1對黃萎病菌敏感。突變體sr1在培養(yǎng)基上病原菌處理12d后，從其葉片中分離的菌落形成數(shù)量是野生型的8倍，說明突變體sr1對黃萎病菌敏感的原因是由侵入其體內(nèi)的菌落數(shù)量

5、所致。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)突變體萌發(fā)較野生型要慢，根長明顯短于野生型，抽薹時間比WT晚，后期生殖階段和WT的差異不顯著。土壤中生長30d后，二者地上部分的鮮重區(qū)別不大，同時統(tǒng)計了二者的根長，發(fā)現(xiàn)差異不明顯。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺銨處理一定程度上能恢復(fù)突變體sr1的根長。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)突變體根短的原因是伸長區(qū)細(xì)胞長度變短所致。遺傳分析表明突變體sr1是單基因隱性突變，通過圖位克隆的技術(shù)分析得知該基因位于5號染色體上端。突變體s63在正常培養(yǎng)基上生長8d，用黃

6、萎病菌處理8 d后，子葉比野生型要先褪綠，接著萎黃；隨著接種處理時間的增加其子葉開始干枯，植株葉片干枯的數(shù)量也開始增多；同時植株花青素積累程度隨著時間的增加而加劇。接種40d左右，植株先于WT抽薹，生命周期縮短。土壤接種32d后，s63葉片萎蔫枯黃程度比WT明顯。培養(yǎng)基中接種18d后野生型WT的相對花青素含量是s63的1.4倍。菌處理9d后，子葉葉綠素含量下降幅度是野生型的2.5倍，結(jié)果表明突變體對黃萎病菌敏感。從突變體s63在培養(yǎng)基上

7、接種12d的葉片中分離出的菌落數(shù)量約是WT的7倍，說明突變體s63對黃萎病菌敏感的原因是由侵入其體內(nèi)的菌落數(shù)量所致。臺盼藍(lán)染色結(jié)果表明培養(yǎng)基上處理8d的幼苗，其不管根尖還是子葉死細(xì)胞均多與野生型。這說明s63是對黃萎病菌敏感的突變體。突變體s133的表型與s63相似，培養(yǎng)基上黃萎病菌處理8 d后，子葉先于野生型褪綠萎黃，隨著處理時間的增加子葉開始干枯；同時花青素積累程度逐漸加劇。接種45 d后植株葉片干枯程度較WT嚴(yán)重，抽薹開花時間早于