煙草激活標(biāo)簽突變體庫的構(gòu)建與分析.pdf

1、煙草是植物生物學(xué)研究的模式植物，又是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，隨著二倍體煙草全基因組測序的完成，煙草研究進(jìn)入了后基因組學(xué)時代。在功能基因組學(xué)時代，突變體是研究基因功能最直接、最有效的途徑之一。本研究作為煙草基因組計劃重要組成部分之一，構(gòu)建了煙草激活標(biāo)簽突變體庫，并從突變表型觀察、T-DNA插入位點(diǎn)分布規(guī)律和插入位點(diǎn)旁側(cè)基因的表達(dá)分析三個方面對該突變體庫做出評價，為大規(guī)模挖掘煙草基因的功能奠定基礎(chǔ)。
　　1.本研究以煙草主栽品種“紅花大

2、金元”為受體，利用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，創(chuàng)制了10萬份激活標(biāo)簽(pSKI015)突變體。在遺傳轉(zhuǎn)化過程中，采用100-150 mg/L的特美汀(Timentin)有效抑制細(xì)菌的生長;將暗培養(yǎng)時間延伸至共培養(yǎng)后的第一輪篩選，提高了煙草的再生效率;高強(qiáng)度的Basta篩選壓力，產(chǎn)生了高陽性率的轉(zhuǎn)基因植株(90％)。對34份轉(zhuǎn)基因株系southern blot分析顯示，88％的測試株系含有一到兩個T-DNA插入，平均1.6個拷貝，因此

3、10萬份突變體包含14.4萬個T-DNA插入。
　　2.本研究經(jīng)過三年的大田突變表型鑒定，累計鑒定近千份具有突變表型的突變體，突變類型主要包括葉形態(tài)、花形態(tài)、株高、分枝、腋芽、育性、花期等。2012年種植了4，105份T1代株系，共鑒定出311份具有突變表型的T1代株系，2013年種植其中234份有突變表型的T2代株系，調(diào)查表型在T1和T2代間的遺傳規(guī)律，59份(1/4) T2代植株保持了T1代的表型，其中36份(1/6)呈現(xiàn)出顯

4、性和半顯性表型。
　　3.本研究利用融合嵌套PCR(FPNI，fusion primer and nested integrated PCR)方法擴(kuò)增1，257份轉(zhuǎn)基因植株，測序1，417條序列，通過blast程序與煙草基因組進(jìn)行比對，獲得了998條側(cè)翼序列(FSTs，F(xiàn)lanking sequence tags)，共計963個單一的T-DNA插入位點(diǎn)。通過插入位點(diǎn)在煙草基因組的分布規(guī)律進(jìn)行分析顯示，T-DNA在煙草中插入位點(diǎn)密度

5、和基因密度呈現(xiàn)正相關(guān)。對插入位點(diǎn)區(qū)間分布進(jìn)行分析顯示，T-DNA在煙草中偏向插入到基因區(qū)和基因周圍5kb范圍內(nèi)的區(qū)域，在基因區(qū)范圍內(nèi)，偏向于插入到UTR區(qū)，和3'UTR相比較，更偏向于5'UTR區(qū)。
　　4.本研究利用半定量PCR對15份在T2代有突變表型的株系進(jìn)行基因的表達(dá)分析，在15個最靠近插入位點(diǎn)的候選基因中，其表達(dá)量上調(diào)有7個，其中6個靠近T-DNA的右邊界，1個靠近不含增強(qiáng)子序列的T-DNA左邊界。其激活距離在750 b