針對(duì)乙肝病毒的CRISPR-Cas9脂質(zhì)載體制劑的研究.pdf

1、慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。乙肝病毒的復(fù)制依賴其模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，但目前慢性乙肝的治療藥物包括干擾素、核苷類似物等，均不能有效清除cccDNA，還易引起病毒的耐藥性突變，使發(fā)展新的治療藥物十分具有意義。
　　CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)是目前基因工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，它是一種由RNA指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的

2、技術(shù)。該技術(shù)具有構(gòu)建方便、高效介導(dǎo)基因定點(diǎn)敲入和基因組點(diǎn)突變、以及更高的安全性等特點(diǎn)，為慢性乙型的治療提供了一種新的思路。人們可以針對(duì)病毒基因組的保守區(qū)域選擇靶點(diǎn)設(shè)計(jì)導(dǎo)向 RNA,引導(dǎo)對(duì)病毒基因組特別是cccDNA的清除。
　　我們針對(duì)乙肝病毒的基因組設(shè)計(jì)了多條導(dǎo)向 RNA(guide RNA，gRNA),構(gòu)建了 CRISPR/Cas9質(zhì)粒，在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型上篩選并驗(yàn)證了它們抑制乙肝病毒和清除乙肝病毒cccDNA的效果。

3、>　　在證明此系統(tǒng)的抗乙肝病毒效果后，我們針對(duì)DNA作為基因藥物體內(nèi)作用的瓶頸問(wèn)題：缺乏高效、安全的體內(nèi)輸送系統(tǒng)，開展了進(jìn)一步研究。我們嘗試?yán)帽緦?shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的兩種具有不同電離態(tài)的陽(yáng)離子脂質(zhì)構(gòu)建 CRISPR/Cas9質(zhì)粒的輸送載體，獲得了粒徑均一、并在血清條件下穩(wěn)定的納米載體粒子，并對(duì)其通過(guò)靜脈注射轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞并抑制乙肝病毒的效果進(jìn)行了深入研究。我們使用模擬乙肝病毒感染的小鼠（尾靜脈高壓注射1.3倍乙肝病毒質(zhì)粒）作為動(dòng)物模型，考察脂質(zhì)和C