克隆豬印跡基因表達及其甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、豬的器官極可能成為人類未來器官的供應源，豬體細胞核移植及轉基因的研究雖然取得了一定的進展，但總體來看核移植效率還很低（1％-2％）。印跡基因對動物的生長發(fā)育起重要作用，在自然繁殖的動物中，基因印跡是通過配子形成過程中甲基化狀態(tài)的改變而建立的，而克隆動物未經(jīng)過配子形成階段，而是直接將體細胞注入去核的卵中進行發(fā)育，這極有可能造成印跡基因的表觀遺傳修飾異常以及表達異常。本研究擬通過對克隆豬胚胎以及克隆豬個體中印跡基因的表達及甲基化狀態(tài)進行研究

2、，探索印跡基因的甲基化狀態(tài)與表達對克隆豬胚胎發(fā)育的影響，希望為提高豬體細胞核移植效率提供理論依據(jù)。主要研究結果如下：
　　 （1）利用Realtime PCR方法，對四個印跡基因（IGF2、H19、PEG3、GRB10）在存活克隆豬、死亡克隆豬和自然繁殖豬及它們分別對應的胎盤中的表達做了分析，結果表明，四個印跡基因在死亡克隆豬胎盤中的表達水平比存活克隆豬胎盤和自然繁殖豬胎盤低，而存活克隆豬胎盤和自然繁殖豬胎盤之間差異不顯著。四個

3、印跡基因在死亡克隆豬、存活克隆豬及自然繁殖豬個體間的表達水平差異不顯著。這表明印跡基因在胎盤中的表達異?？赡苁强寺∝i發(fā)育失敗的重要原因。
　　 （2）利用亞硫酸氫鹽修飾后測序方法，對IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在存活克隆豬、死亡克隆豬和自然繁殖豬及它們分別對應的胎盤中的甲基化做了分析，結果表明，IGF2和H19基因在死亡克隆豬胎盤中的甲基化水平比存活克隆豬胎盤和自然繁殖豬胎盤高，而存活克隆豬胎盤和自然繁殖豬胎盤

4、之間差異不顯著。IGF2和H19基因在死亡克隆豬、存活克隆豬及自然繁殖豬個體間的甲基化水平差異不顯著。這表明印跡基因在胎盤中的表達異?？赡苁怯捎≯E基因甲基化的異常造成的。
　　 （3）利用亞硫酸氫鹽修飾后測序方法，對IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在植入前核移植胚胎及體外受精胚胎中的甲基化變化做了分析，結果表明，IGF2和H19基因在核移植胚胎中呈現(xiàn)去甲基化趨勢，去甲基化主要發(fā)生在1-細胞的6-15小時及2-細胞期

5、，且兩個印跡基因去甲基化的程度相似，這可能是由核移植過程中重編程的不完全造成的。
　　 （4）利用免疫外科手術法，對體外受精和核移植的囊胚進行了內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層的分離，通過對內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層標志性基因的檢測，證明我們分離內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層的方法是正確有效的。
　　 （5）利用亞硫酸氫鹽修飾后測序方法，對IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在核移植胚胎的內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層中的甲基化做了分析，結果表明，核移植胚胎內(nèi)細胞

6、團和滋養(yǎng)層均有不同程度的甲基化異常，內(nèi)細胞團較滋養(yǎng)層的甲基化趨于正常，這表明印跡基因甲基化正常的細胞優(yōu)先參與內(nèi)細胞團的形成，而印跡基因甲基化異常的細胞優(yōu)先參與滋養(yǎng)層的形成，這可能是胎盤印跡基因異常的原因。
　　 （6）利用BrdU標記的方法，對1-細胞期核移植胚胎DNA復制的時間進行了檢測，結果表明，1-細胞期核移植胚胎主要在重構胚激活后6-15小時進行DNA復制，與去甲基化的時間相吻合。這表明印跡基因在核移植胚胎中的去甲基化是