克隆綿羊印記相關(guān)基因的DNA甲基化研究.pdf

1、體細(xì)胞核移植技術(shù)在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等諸多領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。盡管利用該技術(shù)已經(jīng)成功獲得了多種克隆動(dòng)物，但隨之而來(lái)的克隆胚胎及個(gè)體成活率低、不同種屬普遍存在的LOS(large offspring syndrome)等異常制約了體細(xì)胞核移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前，有許多學(xué)者認(rèn)為不完全表觀重編程是克隆效率低下的原因。本研究通過(guò)檢測(cè)新生死亡克隆綿羊印記相關(guān)基因的：DNA甲基化水平，探究克隆綿羊：DNA甲基化的重編程程度。
　　 本研

2、究主要采用重亞硫酸鹽修飾測(cè)序法(BSP)和甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)了2—3日齡死亡克隆蒙古綿羊腎臟、肺臟、肝臟、心臟和肌肉組織中8個(gè)印記相關(guān)基因的DNA甲基化水平與正常對(duì)照的異同，其中克隆個(gè)體羔羊2只，正常對(duì)照2只。此外，本研究進(jìn)一步比較分析了Igf2r、DIK1、Xist和Peg10在克隆綿羊D2和正常對(duì)照五種組織中的mRNA表達(dá)情況。在進(jìn)行上述分析之前，本研究首先克隆了部分基因片段。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到如下結(jié)果：
　　 (

3、1)本研究成功克隆到了綿羊Peg10 1163bp的擬DMR序列(GI：269838596)，848bp綿羊Peg10部分eDNA序列(GI：285014443)，764bp的綿羊xi8t第一外顯于5’端序列及483bp的cDNA序列(GI：285014445)，307bp的綿羊Peg3第一外顯子5’端序列。
　　 (2)綿羊Peg105’端CpG島內(nèi)205bp范圍內(nèi)區(qū)域?yàn)椴町惣谆瘏^(qū)域。
　　 (3)綿羊Peg3外顯子

4、5’端CpG島內(nèi)232bp范圍內(nèi)11個(gè)CpG二核苷酸對(duì)上的胞嘧啶在2—3日齡綿羊腎臟和肺臟中基本完全甲基化。
　　 (4)綿羊Cdkn1c外顯子5’端CpG島內(nèi)188bp范圍內(nèi)19個(gè)CpG二核苷酸對(duì)上的胞嘧啶在2—3日齡綿羊腎臟和肺臟中基本非甲基化。
　　 (5)綿羊腳“轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游CpG島內(nèi)188bp范圍內(nèi)17個(gè)CpG二核苷酸對(duì)上的胞嘧啶甲基化模式為馬賽克式，該區(qū)域并非差異甲基化區(qū)域。
　　 (6)綿羊H1

5、9啟動(dòng)子區(qū)cpG島內(nèi)cTcF結(jié)合位點(diǎn)III附近121bp范圍內(nèi)6個(gè)CpG二核苷酸對(duì)上的胞嘧啶甲基化模式為馬賽克式，該區(qū)域并非差異甲基化區(qū)域。
　　 (7)克隆綿羊D1、D2各組織各印記相關(guān)基因的DNA甲基化模式與正常對(duì)照基本相同，無(wú)明顯差異，僅D2個(gè)別組織Dlk1甲基化水平略高于正常對(duì)照，D2H19肝組織的甲基化水平高于對(duì)照。
　　 (8)克隆綿羊Xist。MsP甲基化結(jié)果顯示綿羊Xist分析區(qū)域可能為差異甲基化區(qū)域，而

6、且克隆綿羊的甲基化模式與正常對(duì)照無(wú)顯著差異。
　　 (9)半定量RT-PCR結(jié)果顯示綿羊Xist和Igf2r基因表達(dá)基本無(wú)組織差異性，而Peg10的mRNA表達(dá)表現(xiàn)組織特異性，腎臟中表達(dá)水平強(qiáng)于其他組織。
　　 (10)Peg10和D1K1在新生個(gè)體組織中的mRNA表達(dá)水平比其他檢測(cè)基因弱。
　　 (11)克隆綿羊D2腎臟、肺臟、肝臟、心臟和肌肉組織中Xist、Peg10、D1k1和Igf2r基因IRNA的表達(dá)水