急性白血病甲基化譜式分析及DNA甲基化與組蛋白甲基化修飾抑制腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系.pdf

1、研究表明：表觀遺傳學(xué)異常是急性白血病發(fā)病的重要機(jī)制之一，且與白血病的發(fā)展、療效和預(yù)后密切相關(guān)。由于表觀遺傳學(xué)異常的可逆性，表觀遺傳修飾調(diào)控被認(rèn)為是一種極有前途的白血病治療手段。但目前對(duì)急性白血病表觀遺傳學(xué)研究多針對(duì)單一的抑癌基因DNA甲基化或組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化等修飾形式。對(duì)急性白血病甲基化譜式還缺乏了解，對(duì)表觀遺傳學(xué)不同修飾異常之間的相互作用關(guān)系、對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及表觀遺傳學(xué)藥物治療白血病的機(jī)制方面的研究成為近年來(lái)表觀遺傳學(xué)

2、研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　本課題以急性白血病的患者和急性白血病細(xì)胞株作為研究對(duì)象，對(duì)急性白血病的DNA甲基化譜式(CpGislands methylator phenotype CIMP)進(jìn)行分析，探討DNA甲基化譜式與急性白血病患者發(fā)病和預(yù)后判斷的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，對(duì)急性白血病DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾的相互關(guān)系進(jìn)行初步探討，同時(shí)對(duì)表觀遺傳學(xué)藥物5-雜氮-2-脫氧胞嘧啶對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病MOLT4細(xì)胞株的細(xì)胞生物學(xué)活性、DNA

3、/組蛋白甲基化及基因表達(dá)調(diào)控的影響和可能的作用機(jī)制進(jìn)行研究。以期通過(guò)對(duì)以上內(nèi)容的研究對(duì)急性白血病發(fā)病機(jī)制、預(yù)后判斷及表觀遺傳藥物靶向治療急性白血病提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究分為以下三個(gè)部分：
　　第一部分 選取了p15、p16、p57、Id4、CDH1、CDH13、Runx3、MGMT、p14、p73、ASPP1、WIF1、SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、DAPK、DLC-1共18個(gè)目前見(jiàn)報(bào)道的其

4、異常甲基化發(fā)生可能和急性白血病或其他惡性腫瘤有相關(guān)性的腫瘤抑制基因?yàn)槟康幕?；分析基因甲基化在急性白血病發(fā)病中的意義，CIMP表型與急性白血病臨床變量、無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線（RFSrecurrence—free survival）及總生存曲線差異。以探討急性白血病患者DNA甲基化譜（CIMP）與其發(fā)病和預(yù)后判斷的關(guān)系。
　　第二部分 以急性白血病細(xì)胞株U937、HL60、NB4、MOLT4、Jurkat、CA46、Raji為研究對(duì)象，利

5、用BSP+TA克隆的方法定量分析各細(xì)胞株的CIMP標(biāo)志基因P15、P16、CDH1、DLC-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化情況；應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP-qPCR）分析不同細(xì)胞系P15、P16、CDH1、DLC-14個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9甲基化情況。探討在白血病細(xì)胞系中上述4個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子的不同甲基化狀態(tài)與組蛋白H3K9甲基化的相關(guān)性。
　　第三部分 以急性T淋巴細(xì)胞白血病MOLT4細(xì)胞株為研究對(duì)象，研究5-Aza

6、-CdR對(duì)MOLT4細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、增殖活性、克隆形成能力、細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)活性的影響;采用BSP+TA克隆測(cè)序和 CHIP-qPCR研究5-Aza-CdR對(duì)MOLT4靶基因DNA甲基化和組蛋白甲基化的影響；采用Real-time PCR和Western-blot法研究5-Aza-CdR對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的影響，并分析5-Aza-CdR對(duì)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶、組蛋白甲基化酶、HP1蛋白的表達(dá)影響，對(duì)其可能的表觀遺傳作用機(jī)制進(jìn)行探索。

7、>　　結(jié)論如下：
　　1.對(duì)于急性髓系白血病的患者：其P15、P16、P57、Id4、CDH1、CDH13、Runx3、P14、SFRP1,2,5、DAPK和DLC-1這13個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化比正常人明顯增高。其中DLC-1基因在AML復(fù)發(fā)組患者的甲基化率明顯高于AML初治組患者。對(duì)于急性淋巴細(xì)胞白血病的患者：其P15、P16、P57、Id4、CDH1、CDH13、Runx3、P14、P73、ASPP1、WIF1、S

8、FRP1,2,4,5、DAPK、DLC-1這17個(gè)抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū) CpG島甲基化比正常人明顯增高。這17個(gè)基因在急性淋巴細(xì)胞白血病患者初治組和復(fù)發(fā)組的甲基化率沒(méi)有明顯差異。急性髓系白血病患者DAPK基因的甲基化陽(yáng)性率明顯高于急性淋巴細(xì)胞白血病患者，而急性淋巴細(xì)胞白血病患者P73、ASPP1、WIF1、SFRP4、SFRP5這5個(gè)基因的甲基化率明顯高于急性髓系白血病患者。
　　2.在急性髓系白血病患者中：①P16基因與CDH1基

9、因；②P15基因分別與ID4基因和DLC-1基因；③CDH13基因分別與CDH1基因和RUNX3基因的甲基化存在相關(guān)性。在急性淋巴細(xì)胞白血病患者中：①P16基因、CDH1基因、SFRP1基因和DLC-1基因的甲基化存在相互的相關(guān)性；②CDH13基因分別和CDH1基因、P16基因;ID4基因和 DLC-1基因之間存在甲基化相關(guān)性。上述現(xiàn)象說(shuō)明急性白血病中部分抑癌基因甲基化有協(xié)同現(xiàn)象，但目前機(jī)制未明。
　　3.CpG島甲基化譜式（CI

10、MP）分析對(duì)預(yù)測(cè)急性白血病的進(jìn)展和預(yù)后具有重要的價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)CIMP表型陽(yáng)性的急性白血病患者其1年內(nèi)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)為CIMP表型陰性患者的3.184倍，其3年復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)為CIMP陰性的患者的2.381倍。CIMP表型陽(yáng)性的患者其1年內(nèi)死亡的風(fēng)險(xiǎn)為CIMP表型陰性患者的2.959倍，其3年死亡的風(fēng)險(xiǎn)為CIMP陰性患者的2.438倍。
　　4.對(duì)于急性白血病細(xì)胞株HL60、Ca46和Molt細(xì)胞，其抑癌基因P15和CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)

11、DNA甲基化與組蛋白H3K9me3甲基化水平正相關(guān)；對(duì)于急性白血病細(xì)胞株Molt4、NB4和U937細(xì)胞，其 P16基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與組蛋白H3K9me3甲基化水平正相關(guān)；對(duì)于急性白血病細(xì)胞株Molt4、NB4和Raji細(xì)胞，其DCL-1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與組蛋白H3K9me3甲基化水平正相關(guān)。上述研究結(jié)果提示急性白血病抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和組蛋白H3K9me3的甲基化呈正相關(guān)。
　　5.5-Aza-CdR能

12、夠通過(guò)逆轉(zhuǎn)急性白血病MOLT4細(xì)胞P15、CDH1、DLC-1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA和組蛋白H3K9 me3甲基化水平，使沉默的腫瘤抑制基因恢復(fù)表達(dá)，從而明顯抑制急性T淋巴細(xì)胞白血病MOLT4細(xì)胞增殖；
　　6.5-Aza-CdR可能通過(guò)以下三點(diǎn)發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用：①直接抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和組蛋白甲基化酶SUV39h和G9a的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)DNA和組蛋白的高甲基化；②5-Aza-CdR在直接下調(diào)