尋找新的組蛋白賴氨酸去甲基化酶和甲基化賴氨酸識(shí)別蛋白.pdf

1、組蛋白賴氨酸甲基化修飾是“組蛋白密碼”假說的重要組成部分，在生物體的生命活動(dòng)中扮演著重要功能。組蛋白賴氨酸甲基化是由賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化SAM產(chǎn)生，由甲基化賴氨酸識(shí)別蛋白與其結(jié)合體現(xiàn)其功能，也能夠由組蛋白去甲基化酶將其移除。目前還有多個(gè)組蛋白甲基化位點(diǎn)對應(yīng)的去甲基化酶沒有被發(fā)現(xiàn)，而發(fā)現(xiàn)新的組蛋白甲基化賴氨酸識(shí)別蛋白有助于更深入理解組蛋白甲基化的生物學(xué)功能。
　　在本研究的第一部分中，我們嘗試尋找新的組蛋白賴氨酸去甲基化酶。我們發(fā)現(xiàn)

2、，在體外的GST pull-down實(shí)驗(yàn)中，AlkB家族蛋白質(zhì)ALKBH7能夠結(jié)合組蛋白，并且能夠在以組蛋白為底物的去甲基化實(shí)驗(yàn)中減弱H4K20me2的抗體信號(hào)，但該活性相當(dāng)微弱，我們的多種嘗試均不能使其增強(qiáng)。該結(jié)果沒能在以H4K20me2甲基化多肽為底物的質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中得到確證。我們接著通過免疫熒光和細(xì)胞組份分離實(shí)驗(yàn)表明，ALKBH7定位于線粒體。免疫沉淀-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ALKBH7同NDUFS3等多個(gè)蛋白相互作用。根據(jù)最近報(bào)道的ALK

3、BH7的晶體結(jié)構(gòu)與脯氨酸羥化酶PHD2的相似性，我們設(shè)計(jì)了多條多肽，通過質(zhì)譜技術(shù)尋找ALKBH7的底物，但皆未能得到陽性結(jié)果。
　　在本研究的第二部分中，我們探索FMR1作為一個(gè)新的組蛋白甲基化賴氨酸識(shí)別蛋白的可能性。我們發(fā)現(xiàn)，在體外的GST pull-down實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)MR1 N端能夠結(jié)合組蛋白，且該相互作用依賴于組蛋白的翻譯后修飾。但在隨后的peptidearray，peptide pull-down等實(shí)驗(yàn)中，我們沒有能夠確定

4、FMR1具體的結(jié)合位點(diǎn)。我們的免疫熒光和細(xì)胞組份分離實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)MR1同細(xì)胞核存在緊密的聯(lián)系，但ChIP-cloning實(shí)驗(yàn)表明FMR1不與染色質(zhì)相互作用。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FMR1被敲低時(shí)，蛋白P55的水平發(fā)生了顯著上升，該現(xiàn)象可能為最近報(bào)道的FMR1敲低抑制γH2AX的生成提供了新的解釋。
　　本研究的第三部分探索了純化的化學(xué)交聯(lián)的CD3-HER2雙特異性抗體在介導(dǎo)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞中的功能。我們發(fā)現(xiàn)，該雙特異性抗體對CIK