PI3K-AKT和MEK-ERK通路調控H3K27me3甲基化酶和去甲基化酶基因表達的研究.pdf

1、組蛋白甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,參與基因的表達調控。組蛋白H3K27me3是抑制基因轉錄的表觀遺傳修飾標記之一,可以抑制靶基因的轉錄。目前研究發(fā)現,組蛋白H3K27me3受組蛋白甲基化酶和去甲基化酶的調控。其中,Zester同源增強子2是組蛋白H3K27甲基化轉移酶,EZH1是它的同源物,它們都是Polycomb蛋白家族的成員。UTX和JMJD3是組蛋白H3K27me3去甲基化酶。PI3K/AKT信號通路對組蛋白甲基化酶EZH2基

2、因表達已經有報道,但在成肌細胞分化過程中是否調控組蛋白H3K27甲基化酶和去甲基化酶的表達還不清楚,我們用小鼠成肌細胞C2C12為研究材料,采用免疫印跡、染色質免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,CHIP)、定量PCR(Q-PCR)的方法研究PI3K/AKT信號通路在成肌細胞分化階段對組蛋白H3K27甲基化酶EZH1/EZH2和去甲基化酶UTX/JMJD3的表達調控。此外,在多種腫瘤組織中檢測到EZH2

3、存在過表達的現象,UTX和JMJD3也被檢測到發(fā)生突變或者表達下降。MEK/ERK信號通路是生物體內廣泛存在的一條信號通路,參與調控細胞的生長、增殖、分化和凋亡等生命過程。在某些癌癥細胞中,MER/ERK信號通路參與調控EZH2基因的表達。為了進一步研究這條通路對組蛋白甲基化酶和去甲基化酶的調控。我們以C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-61-6、RD五種細胞系為研究對象,用RT-PCR和Western-Bloting方法分

4、析檢測MER-ERK信號通路對組蛋白H3K27甲基化酶EZH2/EZH1基因和去甲基化酶UTX/JMJD3基因的表達。結果如下:
　　磷酸化的AKT在成肌細胞分化過程中逐漸升高,EZH1和JMJD3蛋白表達變化不明顯,EZH2蛋白表達降低,到第6和第7d蛋白降到最低值,UTX蛋白表達升高。
　　成肌細胞分化過程中用PI3K/AkT信號通路激活劑處理24h后,Myogenin和MCK蛋白表達升高,H3K27me3在Myogen

5、in基因啟動子區(qū)和MCK基因啟動子及增強子區(qū)的富集與對照組相比降低。UTX蛋白表達略微升高,JMJD3、EZH1和EZH2蛋白與對照相比變化不明顯。用PI3K/AKT號通路抑制劑處理24h后,Myogenin和MCK蛋白表達降低,H3K27me3在Myogenin基因啟動子區(qū)和MCK基因啟動子及增強子區(qū)的富集與對照組相比升高,UTX和EZH2蛋白表達均降低,其中JMJD3和EZH1蛋白表達降低不明顯。
　　不同濃度的MEK/ERK

6、信號通路抑制劑U0126(0、10、20、40umol/L)處理24h后,在五種細胞磷酸化的ERK1/2表達水平隨著濃度的升高逐漸降低;EZH1和EZH2基因mRNA表達水平與對照相比有不同程度的降低,EZH1基因mRNA表達變化沒有達到顯著水平,EZH2mRNA在NIH3T3、C2C12、RD、HEPA1-6四種細胞表達變化達到顯著水平(P<0.05),EZH2蛋白表達在五種細胞系內都降低,其中C127細胞變化最不明顯,HEPA1-6

7、細胞變化最為顯著。組蛋白H3K27me3去甲基化酶UTX基因在C2C12、C127、NIH3T3、HEPA1-6、RD五種細胞mRNA表達變化不明顯,JMJD3基因mRNA表達變化達到顯著水平(P<0.05),JMJD3蛋白表達普遍升高,但在RD細胞蛋白表達升高不明顯。
　　對HEPA1-6細胞免疫熒光檢測,EZH1和UTX蛋白在細胞質和細胞核內都有表達,EZH2蛋白在細胞核內表達比較強,JMJD3在細胞質內表達比較強。加入MEK

8、/ERK信號通路抑制劑U0126處理細胞24h后,與對照相比,EZH2、EZH1、UTX、JMJD3變化不明顯。
　　MEK/ERK信號通路抑制劑U0126處理HEPA1-6和RD兩種細胞系24h后,在兩種細胞的細胞核內EZH1表達變化不明顯,EZH2蛋白表達顯著降低。UTX和JMJD3蛋白在HEPA1-6細胞細胞核內表達升高,在RD細胞細胞核沒有明顯變化。
　　用MEK/ERK信號通路抑制劑U0126處理HEPA1-6細胞

9、,不同的時間點檢測蛋白表達的變化。U0126處理2hP-ERK1/2降低,隨后表達水平逐漸升高,到24h升高到最大,但與對照相比仍然降低。EZH1沒有明顯變化。EZH2蛋白處理8h后蛋白表達減弱明顯,24h蛋白表達降低到最低水平。JMJD3和UTX蛋白在處理4h后表達升高到最大值,隨后表達逐漸減弱。
　　siRNA-ERK1、siRNA-ERK2、siRNA-ERK1/2干擾HEPA1-6細胞,EZH2和EZH1蛋白表達都有不同程

10、度的降低,EZH1變化不明顯,JMJD3蛋白表達明顯升高,但UTX在siRNA-ERK1干擾后蛋白升高不明顯,siRNA-ERK2和siRNA-ERK1/2干擾后蛋白表達升高明顯。
　　結論:PI3K/AKT信號通路在成肌細胞分化過程中可能參與調控EZH2和UTX的表達,但可能有別的信號通路共同參與調控。MEK/ERK信號通路對EZH1沒有明顯的調控作用,可能參與調控EZH2、UTX和JMJD3基因的表達,但這種調控具有細胞特異性