賴氨酸特異性去甲基化酶1在卵巢癌細胞增殖和凋亡中作用的研究.pdf

1、背景和目的：賴氨酸特異性去甲基化酶1（lysine-specific demethylase1， LSD1）是2004年發(fā)現(xiàn)的一種黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinulcleotide, FAD）依賴性胺氧化酶，它能通過氧化反應生成甲醛而特異性去除組蛋白H3第4位賴氨酸（H3K4）和第9位賴氨酸（H3K9）的甲基化修飾，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄的激活與抑制，發(fā)揮重要的生物學功能。最近的研究顯示LSD1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖

2、及遷移侵襲中扮演重要的角色。目前已有研究報道LSD1在卵巢癌組織和細胞株中高度表達，而與卵巢癌細胞增殖關系尚不明確。因此，本研究以卵巢癌細胞HO8910為研究對象，探索LSD1基因過表達、敲低及其酶活性抑制對HO8910細胞增殖、周期和凋亡的影響，以及對細胞增殖和凋亡相關基因表達的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：1.利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定干擾LSD1的卵巢癌HO8910細胞株，首先合成特異性針對LSD1基因的shRNA，插入pLKO-Tet

3、-On載體，構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒 pLKO-Tet-On-shLSD1；然后將 pLKO-Tet-On-shLSD1、pHR’-CMV-8.2ΔVPR和 pHR’-CMV-VSVG三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine2000包裝產(chǎn)生慢病毒；再將攜帶有LSD1-shRNA的慢病毒感染HO8910細胞，采用嘌呤霉素篩選LSD1-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)入的HO8910細胞。
　　2.構(gòu)建穩(wěn)定過表達 LSD1的卵巢癌

4、細胞株，首先用 Lipofectamine2000將pLVX-Tet-On、pHR’-CMV-8.2ΔVPR及pHR’-CMV-VSVG三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，收集病毒上清感染 HO8910細胞，采用 G418篩選細胞得到穩(wěn)定的HO8910-rtTA細胞；再用包含 pLVX-tight-puro-LSD1的慢病毒顆粒感染HO8910-rtTA細胞，用嘌呤霉素篩選細胞得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達LSD1細胞株。
　　3.用實時定量 RT-

5、PCR和 Western blot法分別檢測 LSD1干擾（LSD1-knockdown, LSD1-KD）和過表達（LSD1-overexpression, LSD1-OE）的HO8910細胞中LSD1 mRNA和蛋白的表達及其底物H3K4me2表達水平。
　　4.利用不同濃度（0、25、50、100μmol/L）LSD1特異性抑制劑tranylcypromine(TCP)處理HO8910細胞，采用MTT法和EdU DNA標記法

6、檢測細胞的增殖；在LSD1-KD和LSD1-OE HO8910細胞中，加入不同濃度（0、1、10、100 ng/mL） doxycycline(Dox)誘導LSD1敲低或過表達后，檢測細胞增殖的變化。
　　5.采用Annexin V/PI和流式細胞儀分別檢測上述不同處理組中細胞凋亡和細胞周期的變化。
　　6.利用Western blot法檢測不同處理組細胞中P21、Bax、Bcl-2和Survivin蛋白的表達水平。

7、　　結(jié)果：成功建立了穩(wěn)定干擾LSD1和過表達LSD1的卵巢癌HO8910細胞株；干擾LSD1基因表達或抑制LSD1酶活性，能夠顯著抑制HO8910細胞的增殖和促進細胞的凋亡（P﹤0.05）；而 LSD1過量表達，則顯著促進 HO8910細胞的增殖及抑制細胞的凋亡。此外，LSD1表達下調(diào)誘導細胞周期阻滯在G1期，并下調(diào)促存活蛋白Bcl-2和Survivin的表達，以及上調(diào)促凋亡蛋白P21和Bax表達；相反，外源性表達LSD1能夠促進HO8