人卵子印跡基因H19和MEST甲基化狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 基因印跡是指親本來源不同的一對(duì)等位基因表達(dá)活性不同的遺傳現(xiàn)象。印跡基因在促進(jìn)胚胎生長發(fā)育、維持胎盤功能、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育和心血管形成和調(diào)控神經(jīng)行為等方面起重要作用。甲基化是印跡的主要方式，已知的絕大多數(shù)印跡基因存在胞嘧啶差異性甲基化，即父源和母源等位基因中只有一個(gè)發(fā)生甲基化，甲基化的等位基因不表達(dá)。小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，印跡基因在原始生殖細(xì)胞遷入生殖嵴的時(shí)候開始去甲基化，然后在生殖細(xì)胞分化成熟的各個(gè)階段逐漸重新甲基化而獲得印跡。這些

2、處于變化時(shí)期的印跡基因顯得十分脆弱而敏感，易受到外界環(huán)境如外源激素、體外操作、細(xì)胞培養(yǎng)等的影響而造成印跡異常。人類輔助生殖技術(shù)(ART)涉及激素的使用，也可能對(duì)人卵子的印跡產(chǎn)生影響。但人類促排卵后卵子的基因印跡改變的研究較少，尚沒有確切的結(jié)論。亞硫酸氫鈉測(cè)序是卵子印跡基因甲基化研究中廣為使用的方法，但報(bào)道的PCR(polymerasechainreaction)成功率都較低。本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)單細(xì)胞低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋和亞硫酸氫鈉處理的方法，采

3、用半巢式PCR的方法擴(kuò)增人單個(gè)卵細(xì)胞父源印跡基因H19和母源印跡基因MEST，大大提高PCR擴(kuò)增成功率。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序明確H19和MEST的甲基化狀態(tài)，通過比較自然周期及超促排周期各級(jí)卵子的甲基化情況，探討人卵子H19和MEST基因印跡建立的時(shí)序以及超促排卵對(duì)印跡建立及維持的影響，旨在進(jìn)一步研究ART對(duì)基因印跡的影響，為提高ART安全性和臨床治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 捐贈(zèng)的卵子用透明質(zhì)酸酶結(jié)合機(jī)

4、械吹打體視顯微鏡下去除顆粒細(xì)胞，鹽酸(pH1.5)去除透明帶，倒置顯微鏡下確認(rèn)卵細(xì)胞周圍已無顆粒細(xì)胞等體細(xì)胞；之后，分別使用常規(guī)和改進(jìn)的方法進(jìn)行低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋和亞硫酸氫鈉處理。改進(jìn)的方法利用顯微鏡直視下包埋單個(gè)卵細(xì)胞，并采用1.5min沸水浴變性既保證了徹底變性又不至于造成單個(gè)細(xì)胞DNA降解。通過半巢式PCR、雙重PCR擴(kuò)增H19和MEST基因片段，其中包括18個(gè)H19CpG位點(diǎn)和24個(gè)MESTCpG位點(diǎn)。利用亞硫酸氫鈉將非甲基化的胞

5、嘧啶(C)化學(xué)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)的原理，保留PCR擴(kuò)增前卵細(xì)胞DNA的甲基化信息，通過測(cè)序結(jié)果了解印跡基因H19和MEST甲基化情況。實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)部分：1、單細(xì)胞亞硫酸氫鈉測(cè)序體系的建立。2、自然周期MⅠ和MⅠⅡ卵子及超促排卵的GV、MⅠ和MⅡ卵子印跡基因H19和MEST的甲基化狀態(tài)。 結(jié)果： 一、PCR擴(kuò)增及測(cè)序 1、常規(guī)低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋亞硫酸氫鈉處理的PCR成功率：包埋94個(gè)卵細(xì)胞，由于操作不慎丟失3個(gè)，獲得

6、91個(gè)瓊脂小球(組A)，沸水浴變性時(shí)間均為15min以上，僅有9個(gè)PCR擴(kuò)增成功，成功率為9.89％。 2、改進(jìn)后的低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋亞硫酸氫鈉處理的PCR成功率：包埋125個(gè)卵子，共獲得125個(gè)瓊脂小球，其中28、37和60個(gè)瓊脂小球的沸水浴變性時(shí)間分別為15min或以上(組B)，2min～15min(組C)和1.5min(組D)，PCR擴(kuò)增成功率分別為28.57％(8/28)、48.65％(18/37)和81.67％(49/6

7、0)。采用改進(jìn)包埋方法同時(shí)1.5min沸水浴的瓊脂小球(組D)的PCR成功率最高，與其他三組比較的差異有顯著性(P＜0.01)。 3、測(cè)序：將存在條帶的41個(gè)H19和32個(gè)MEST第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測(cè)序，每個(gè)樣至少測(cè)5個(gè)克隆，結(jié)果完全符合理論預(yù)期。自然卵子H19CpG位點(diǎn)共18個(gè)，均為非甲基化，經(jīng)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增后顯示為“TG”；MESTCpG位點(diǎn)共24個(gè)，均為甲基化，亞硫酸氫鈉不能將其轉(zhuǎn)化，PCR擴(kuò)增后仍顯示為“CG

8、”。發(fā)現(xiàn)其中3個(gè)樣品產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果同時(shí)存在所有位點(diǎn)完全甲基化和完全非甲基化兩種情況，提示可能為體細(xì)胞污染所致，總污染率為6.12％(3/49)。 二、CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài) 1、自然卵子：MⅠ卵子H19完全非甲基化，MEST完全甲基化。MⅡ和MⅠ卵子完全一致。 2、超排GV卵子：所有檢測(cè)H19的11個(gè)卵子呈現(xiàn)所有位點(diǎn)的完全非甲基化，所有檢測(cè)MEST的6個(gè)卵子呈現(xiàn)所有位點(diǎn)的完全甲基化。 3、超排MⅠ卵子：檢

9、測(cè)H19的11個(gè)呈現(xiàn)所有位點(diǎn)的完全非甲基化，檢測(cè)MEST的9個(gè)卵子，8個(gè)為所有位點(diǎn)的完全甲基化，1個(gè)出現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)非甲基化。 4、超排MⅡ卵子：檢測(cè)H19的11個(gè)卵子，9個(gè)為所有位點(diǎn)的完全非甲基化，1個(gè)出現(xiàn)兩個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化，1個(gè)出現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)甲基化，這兩個(gè)卵子的MEST基因沒有發(fā)現(xiàn)非甲基化情況。檢測(cè).MEST的10個(gè)卵子，8個(gè)為所有位點(diǎn)的完全甲基化，1個(gè)出現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)非甲基化，1個(gè)出現(xiàn)單個(gè)位點(diǎn)非甲基化，這兩個(gè)卵子的H19基因沒有發(fā)

10、現(xiàn)甲基化位點(diǎn)。這些甲基化異常的位點(diǎn)絕大部分位于基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵區(qū)域。 結(jié)論： 1、改進(jìn)的低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋后亞硫酸氫鈉測(cè)序可以檢測(cè)單細(xì)胞印跡基因的甲基化狀態(tài)，該體系穩(wěn)定可靠，PCR成功率高，體細(xì)胞污染少，結(jié)果明確。雙重PCR同時(shí)檢測(cè)同個(gè)卵子兩個(gè)印跡基因，既可以全面了解甲基化情況又減少了所需樣本數(shù)量。 2、自然MⅠ和MnⅡ卵子H19甲基化已經(jīng)完全去除，MEST甲基化已經(jīng)完成，提示印跡在MⅠ和MⅡ階段已經(jīng)建立并得以維