超促排卵和體外成熟人卵子中印跡基因H19和PEG1甲基化狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 基因印跡是指親緣依賴(lài)性單等位基因表達(dá)，即父源和母源等位基因中只有一個(gè)表達(dá)，其遺傳方式不符合經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。印跡基因的功能主要與胚胎形成和發(fā)育、胎兒生長(zhǎng)及胎盤(pán)分化等有關(guān)[1]。基因印跡的主要方式是等位基因差異性甲基化，發(fā)生于配子形成過(guò)程中，當(dāng)生殖細(xì)胞遷入生殖嵴后就開(kāi)始了母代印跡的去除及子代相應(yīng)印跡的建立[2-4]。印跡一旦建立，其甲基化狀態(tài)在后續(xù)的各級(jí)發(fā)育中維持不變，即使在受精后廣泛的基因組去甲基化過(guò)程中，印跡基因的

2、甲基化狀態(tài)也維持不變，直到下一代胚胎早期，生殖細(xì)胞發(fā)育時(shí)印跡才得以去除。人類(lèi)輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)中廣泛使用的超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、卵子體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation， IVM)、胚胎體外操作和培養(yǎng)等在印跡形成和維持的關(guān)鍵時(shí)期進(jìn)行，很可能會(huì)導(dǎo)致印記異常的發(fā)生。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ART存

3、在的胚胎種植率低、自發(fā)流產(chǎn)危險(xiǎn)增加、低體重出生兒比例上升和先天畸形率增高等問(wèn)題可能和印跡異常有關(guān)，而ART出生后代的Angelman綜合征(AS)和Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)等罕見(jiàn)印跡遺傳性疾病的發(fā)病率增高[5]，提示ART可能導(dǎo)致印跡異常。研究配子印跡基因的甲基化狀態(tài)是了解ART相關(guān)過(guò)程是否對(duì)印跡產(chǎn)生影響的一個(gè)重要途徑，單個(gè)細(xì)胞的甲基化信息更加準(zhǔn)確。近年來(lái)的動(dòng)物研究表明超促排卵(controlled ovar

4、ian hyperstimulation， COH)[6，7]、卵子體外成熟培養(yǎng)(in vitro maturation，IVM)[8，9]、使用圓形或長(zhǎng)形精子細(xì)胞[10]、體外受精和胚胎培養(yǎng)[11，12]甚至胚胎移植[12]都可能導(dǎo)致基因印跡異常，但有關(guān)人類(lèi)卵子的研究較少。缺乏人類(lèi)卵子印記狀態(tài)研究的主要原因是：人類(lèi)卵子來(lái)源的局限性及相關(guān)倫理問(wèn)題的限制，而且標(biāo)本僅含單個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)技術(shù)難度大。 本研究的目的是：1)采用單細(xì)胞亞硫酸

5、氫鈉測(cè)序分析COH和IVM的各級(jí)卵子印跡基因H19和PEG1的甲基化狀態(tài)，以探討COH和IVM是否引起印跡基因甲基化異常；2)初步探討采用高分辨率熔解(high resolution melting，HRM)分析技術(shù)用于單個(gè)卵子的甲基化異常檢測(cè)，以建立簡(jiǎn)便、快速、低費(fèi)用的甲基化異常檢測(cè)方法。 方法： 來(lái)自單精子卵胞漿內(nèi)注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療周期的COH卵子和

6、來(lái)自IVM治療周期的IVM卵子采用透明質(zhì)酸酶和顯微玻璃管機(jī)械吹打體式顯微鏡下去除顆粒細(xì)胞，鹽酸(pH1.5)去除透明帶，倒置顯微鏡下確認(rèn)卵細(xì)胞周?chē)褵o(wú)顆粒細(xì)胞等體細(xì)胞；之后，使用改進(jìn)的單細(xì)胞低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋亞硫酸氫鈉處理的方法進(jìn)行處理。通過(guò)半巢式、雙重PCR擴(kuò)增H19的18個(gè)CpG位點(diǎn)和PEG1的24個(gè)CpG位點(diǎn)。利用亞硫酸氫鈉將非甲基化的胞嘧啶(C)化學(xué)轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)嘧啶(U)，保留PCR擴(kuò)增前細(xì)胞DNA的甲基化信息，通過(guò)克隆測(cè)序，分析CO

7、H和IVM的各級(jí)卵子印跡基因H19和PEG1的甲基化狀態(tài)。同時(shí)對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物行HRM分析，分析HRM檢測(cè)甲基化異常的可能性。 結(jié)果： 122個(gè)卵子行單個(gè)卵子亞硫酸氫鈉處理后PCR，分別有58個(gè)COH和36個(gè)IVM卵子擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率為77.0％，空白對(duì)照及陰性對(duì)照均未見(jiàn)擴(kuò)增條帶。PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序后，有7個(gè)卵子由于出現(xiàn)甲基化和非甲基化兩種甲基化類(lèi)型，考慮為體細(xì)胞污染，體細(xì)胞污染率為7.4％。 8.5％(8

8、/94)卵子出現(xiàn)H19或PEG1的1～2個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化異常。91.4％卵子的H19是完全非甲基化的，而91.7％卵子的PEG1則是完全甲基化的，沒(méi)有出現(xiàn)所有CpG位點(diǎn)甲基化異常的卵子。在58個(gè)COH卵子中，33個(gè)卵子檢測(cè)H19，30個(gè)所有CpG位點(diǎn)完全非甲基化，1個(gè)MII卵子出現(xiàn)7號(hào)和10號(hào)兩個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化，2個(gè)MII卵子分別出現(xiàn)7號(hào)或10號(hào)CpG位點(diǎn)甲基化；25個(gè)卵子檢測(cè)PEG1，22個(gè)卵子為完全甲基化，1個(gè)MI卵子出現(xiàn)14

9、號(hào)CpG位點(diǎn)非甲基化，2個(gè)MII卵子分別出現(xiàn)8號(hào)和18號(hào)兩個(gè)CpG位點(diǎn)非甲基化。IVM后成熟卵子皆行單精子卵胞漿內(nèi)注射，在36個(gè)未成熟卵子中，25個(gè)卵子行H19檢測(cè)，其中23個(gè)所有位點(diǎn)為完全非甲基化，1個(gè)MI和1個(gè)MII卵子分別出現(xiàn)7號(hào)和10號(hào)兩個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化；檢測(cè)PEG1的11個(gè)卵子所有位點(diǎn)為完全甲基化。 對(duì)所有測(cè)序結(jié)果顯示被體細(xì)胞污染的卵子行HRM分析，其熔解曲線顯示含有2個(gè)熔解溫度(Tm)值，這兩個(gè)Tm值分別與沒(méi)有受到

10、污染的正常印跡的精子和卵子的Tm值一致。對(duì)甲基化狀態(tài)正常、有1個(gè)位點(diǎn)異常和有2個(gè)位點(diǎn)異常樣本通過(guò)HRM分析，顯示HRM可以區(qū)別這些不同的甲基化類(lèi)型。 比較測(cè)序結(jié)果與HRM分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)序結(jié)果顯示體細(xì)胞污染的樣本均能通過(guò)HRM分析獲得證實(shí)，而測(cè)序結(jié)果顯示正常的94個(gè)卵子中2個(gè)通過(guò)HRM分析發(fā)現(xiàn)存在體細(xì)胞污染。這可能是測(cè)序時(shí)克隆數(shù)量較少導(dǎo)致的誤差所致。 結(jié)論： 我們的結(jié)果表明，PEG1已經(jīng)建立的甲基化沒(méi)有受到COH