ES小鼠和ES細(xì)胞中H19基因甲基化狀態(tài).pdf

1、小鼠胚胎干（Embryonic stem，ES）細(xì)胞與四倍體胚胎有不同的發(fā)育潛能，四倍體胚胎僅參與卵黃囊內(nèi)胚層和胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞譜系(如絨毛膜外胚層、滋養(yǎng)巨細(xì)胞等)的生成，而ES細(xì)胞廣泛參與胚體、羊膜、尿囊、卵黃囊中胚層和絨毛膜中胚層的生成，不參與卵黃囊內(nèi)胚層和胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞譜系的生成。利用四倍體胚胎補(bǔ)償技術(shù)，將ES細(xì)胞與四倍體胚胎嵌合，就可以得到完全由ES細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的小鼠，即ES小鼠。
　　 所有的克隆動(dòng)物都是不正常的，這是由于供

2、體細(xì)胞基因組異常的表觀遺傳狀態(tài)所致，那些存活至成年或活的稍長(zhǎng)一點(diǎn)的克隆動(dòng)物只是比早死的克隆動(dòng)物少一些異常而已?？寺?dòng)物后代的異常表型與其重構(gòu)胚早期發(fā)育過(guò)程中的異常表觀重編程（epigenetic reprogramming）有關(guān)。異常的表觀重編程可以導(dǎo)致異常的基因表達(dá)，從而引起克隆動(dòng)物的諸多異常表型。而DNA甲基化（DNA methylation）是真核生物基因的一種重要的表觀遺傳修飾方式，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段，在胚胎的正常發(fā)育過(guò)

3、程中具有顯著作用。通過(guò)對(duì)DNA甲基化模式的研究發(fā)現(xiàn)，克隆動(dòng)物中存在著異常的DNA甲基化狀態(tài)，而這些異常的DNA甲基化模式可能就是導(dǎo)致克隆胚早期死亡以及克隆動(dòng)物發(fā)育畸形的主要原因。已有研究表明，印跡基因的異常表達(dá)會(huì)造成克隆動(dòng)物發(fā)育異常，而調(diào)節(jié)印跡基因表達(dá)的主要分子機(jī)制就是DNA甲基化。據(jù)此我們推測(cè)：與正常個(gè)體相比，新生死亡的克隆動(dòng)物印跡基因的甲基化狀態(tài)很可能發(fā)生了某些變化。
　　 以ICR小鼠胎兒成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，利用高糖DM

4、EM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時(shí)添加15％的胎牛血清、0.1mM的2-巰基乙醇、1％的非必需氨基酸、2mM的L-谷氨酰胺、1000IU/mL的白血病抑制因子(LIF)以及青、鏈霉素各50IU/mL。5％ CO2、飽和濕度、37℃ 培養(yǎng)，由37枚C57BL/6J×129/Sv囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離獲得3株ES細(xì)胞系。
　　 酚提法提取遺傳背景（C57BL/6J×129/sv）相同的正常成年小鼠、正常新生小鼠、成年ES小鼠和新生死亡ES小鼠的尾部

5、組織基因組DNA，利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(methylation sensitive restriction endonuclease，MS-RE)-PCR技術(shù)分別檢測(cè)了各實(shí)驗(yàn)組印跡基因（imprinted gene）H19 5'非翻譯區(qū)兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，發(fā)育至成年的ES小鼠印跡基因H19所檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)與對(duì)照組正常成年小鼠、正常新生小鼠之間都沒(méi)有差異，而新生死亡ES小鼠印跡基因H19所檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)與成

6、年ES小鼠、正常成年小鼠以及正常新生小鼠相比則存在明顯差異。
　　 挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的ES細(xì)胞（C57BL/6J×129/sv）集落，純化后利用上述相同的方法提取ES細(xì)胞基因組DNA并檢測(cè)其印跡基因H19 5'非翻譯區(qū)兩個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。從研究結(jié)果推測(cè)，ES細(xì)胞中印跡基因H19所檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)與成年ES小鼠、正常成年小鼠以及正常新生小鼠之間可能存在差異，而不同傳代次數(shù)的ES細(xì)胞之間印跡基因H19所檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)差異